Bacillus atrophaeus B44產(chǎn)生iturin A及其對(duì)棉苗立枯病的防病促生作用.pdf

1、芽孢桿菌B44是從新疆棉花根際土壤中分離獲得，該菌對(duì)多種土傳植物病原菌均表現(xiàn)出很強(qiáng)的抑菌活性；在田間條件下，該菌對(duì)棉苗立枯病、棉花黃萎病以及加工番茄根腐病害表現(xiàn)出了較好的防治效果。為了進(jìn)一步確定芽孢桿菌B44的種類及其防治棉苗立枯病的生防機(jī)理：本研究采用gyr A基因分析以及全基因組測(cè)序確定B44的分類地位，采用脂肽類抗生素特異性引物擴(kuò)增以及RP-HPLC分析和 MALDI-TOF-MS鑒定確定了B44產(chǎn)生的脂肽類抗生素的種類；通過(guò)特異

2、性引物克隆到了與iturin A合成相關(guān)的ituC基因，并通過(guò)同源重組的方法敲除了該基因，明確了ituC基因?qū)turin A生物合成的重要影響，確定了iturin A是B44菌株防治棉苗立枯病的關(guān)鍵性的脂肽類抑菌活性物質(zhì)；采用單因素和正交設(shè)計(jì)分析了不同碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽對(duì)B44菌株生物量和iturin A產(chǎn)量的影響，通過(guò)盆栽和小區(qū)試驗(yàn)探討了B44菌株防治棉苗立枯病的生防機(jī)理。本研究主要內(nèi)容包括：
　　⑴由于萎縮芽孢桿菌和枯草芽孢

3、桿菌菌生長(zhǎng)性狀的高度相似性往往引起二者的混淆，16S rRNA基因作為傳統(tǒng)的細(xì)菌分子鑒定法，但是它往往受限于親緣關(guān)系較近的芽孢桿菌變種間的分類，因而前期工作將該菌歸為枯草芽孢桿菌，并命名為Bacillus subtilis S44。本研究通過(guò)gyrA基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)和全基因組序列與NCBI基因庫(kù)比對(duì)分析進(jìn)一步確定該菌株的分類地位，確定Bacillus subtilisS44為萎縮芽孢桿菌（Bacillus atrophaeus），并更

4、名為Bacillus atrophaeusB44。
　?、撇捎弥念惪股靥禺愋砸飶腂44菌株擴(kuò)增到 mycosubtilin、fengycins、plipastatins、surfactins和iturin A五種脂肽類型。進(jìn)一步通過(guò)MALDI-TOF-MS分析該菌株的脂肽粗提物，樣品中出現(xiàn)的m/z分別為1028.5、1058.8、1106.4、1121.4、1463.7、1477.7和1505.8。通過(guò)與報(bào)道的脂肽類抗生素m

5、/z比對(duì)和分析，結(jié)果表明B44菌株可產(chǎn)生C13-iturin A，C18-mycosubtilin，C15-surfactin，C16-fengycin A和C16-fengycin B和m/z為1106.4未知的脂肽類抗生素。
　　⑶從B44菌株中擴(kuò)增出ituC基因片段，并將其克隆到pUC19質(zhì)粒上，再通過(guò)tet基因插入到含有ituC基因片段的pUC19質(zhì)粒上，將此重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到野生菌株中通過(guò)含有tet的培養(yǎng)基上篩選突變子。測(cè)定

6、ituC突變株和野生菌株iturin A的產(chǎn)生量以及對(duì)棉立枯病的的生物防效。結(jié)果表明：ituC突變株iturin A的產(chǎn)生量比野生菌株下降了75.9％，通過(guò)MALDI-TOF-MS分析，未檢測(cè)到iturin A，而fengycin和surfactin相對(duì)豐度值也顯著下降；對(duì)立枯病的盆栽防效表明，ituC突變株的平均生物防效為18.8%，比野生菌株的生物防效（47.6%）下降了60.5%。由此表明ituC對(duì)iturin A合成產(chǎn)生重要影響

7、，同時(shí)也表明iturin A是該菌株對(duì)棉立枯病發(fā)揮生物防效的關(guān)鍵性抑菌活性物質(zhì)。
　?、韧ㄟ^(guò)iturin A的RP-HPLC定量分析和平板抑菌活性測(cè)定，分別以不加碳源、不加氮源和不加無(wú)機(jī)鹽的NA培養(yǎng)基為對(duì)照。結(jié)果表明：α-乳糖、果糖、玉米粉iturin A產(chǎn)生量顯著性較高，葡萄糖、麥芽糖、半乳糖和蔗糖iturin A的產(chǎn)生量較低，蔗糖的產(chǎn)生量最低，可溶性淀粉、d-木糖對(duì)iturin A產(chǎn)量增加影響不顯著；Iturin A產(chǎn)量較高的

8、氮源是KNO3，而NaNO3和豌豆粉對(duì)iturin A產(chǎn)量增加影響不顯著，其它氮源Ca(NO3)2、NH4NO3、酵母提取物、NH4Cl、(NH4)2SO4和尿素的iturin A產(chǎn)量均為下降，尿素的產(chǎn)生量為最低；MnSO4、CaCO3和CuSO4對(duì)iturin A產(chǎn)量有顯著的促進(jìn)作用，MgSO4對(duì)iturin A產(chǎn)量增加無(wú)顯著性影響，而ZnSO4、KH2PO4、KCl和FeSO4對(duì)iturin A產(chǎn)量均具有抑制作用，ZnSO4產(chǎn)生的i

9、turin A產(chǎn)量最低。研究表明B44菌株抑菌活性與iturin A的產(chǎn)生量表現(xiàn)為顯著性或極顯著性相關(guān)。由正交實(shí)驗(yàn)得到最高iturin A產(chǎn)量為204.3mg/L，其正交優(yōu)化組合包括玉米粉為10 g/L，豌豆粉5 g/L，果糖為10g/L，KNO3為10g/L，MnSO4為0.05g/L，MgSO4為1.0g/L。
　?、赏ㄟ^(guò)B44菌株不同營(yíng)養(yǎng)發(fā)酵液對(duì)棉苗立枯病的盆栽和小區(qū)防效實(shí)驗(yàn)，研究表明該菌株生物防效與iturin A產(chǎn)生量密

10、切相關(guān)。同時(shí)檢測(cè)到該菌株能夠產(chǎn)生赤霉素和嗜鐵素，且促生作用較強(qiáng)的發(fā)酵液可能與菌株產(chǎn)生較高濃度的赤霉素有關(guān)。通過(guò)單因素與正交優(yōu)化組合發(fā)酵液處理對(duì)棉立枯病的生物防效測(cè)定，正交優(yōu)化組合的盆栽防效達(dá)到72.8%，比單因素KNO3發(fā)酵液提高了10.2%，正交優(yōu)化組合的田間防效為62.6%，比單因素KNO3發(fā)酵液提高了9.1%。通過(guò)對(duì)棉苗SOD、POD和CAT誘導(dǎo)防御性酶酶活測(cè)定，發(fā)現(xiàn)相對(duì)防效較高的處理酶活活性顯著較高。由此表明該菌株生防機(jī)理還與促