LAIR家族的表達及其對LPS誘導DC產(chǎn)生促炎因子的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、白細胞相關免疫球蛋白樣受體（Leukocyteassociatedimmunoglobulinlike-receptor，LAIR）屬于免疫球蛋白超家族成員。它是1983年用大顆粒淋巴細胞免疫小鼠，制備對NK細胞殺傷有抑制作用的抗體時發(fā)現(xiàn)的。人LAIR家族包含LAIR-1和LAIR-2兩個成員。在第八屆人類白細胞分化抗原會議上分別被命名為CD305及CD306。人LAIR基因位于人19號染色體（19q13.42）上被稱為白細胞免疫球蛋白

2、樣受體復合體（LeukocyteIg-likereceptorcomplex，LRC）中。LAIR-1和LAIR-2基因轉(zhuǎn)錄方向相反。LAIR-1cDNA全長1728bp，有4個不同的異型。人LAIR-1是一個含有287個氨基酸的Ⅰ型跨膜糖蛋白，胞膜外區(qū)有一個Ig樣結(jié)構域，胞漿區(qū)含有兩個免疫受體酪氨酸抑制性模體（immunoreceptortyrosine-basedinhibitorymotifs，ITIMs）。LAIR-2基因編碼的

3、蛋白質(zhì)與LAIR-1胞膜外區(qū)有近84％的同源性，含有135個氨基酸，沒有跨膜區(qū)和胞質(zhì)區(qū)結(jié)構域，為一種分泌蛋白，LAIR-2有3個不同的異型。編碼小鼠LAIR-1（mLAIR-1）的基因位于小鼠7號染色體的最末端，相當于人的LRC所處的19q13.42區(qū)域。人LAIR-1與LAIR-2有相似的表達特點，主要表達于造血細胞。用抗體交聯(lián)人LAIR-1，其胞漿區(qū)可募集酪氨酸磷酸酶SHP-1和SHP-2，轉(zhuǎn)導抑制性信號，抑制細胞功能。小鼠LAIR

4、-1與人LAIR-1有相似的結(jié)構特征，在氨基酸水平有40％的同源性。它也廣泛表達于各種免疫細胞，介導抑制性功能。特異性抗體交聯(lián)小鼠LAIR-1，胞漿區(qū)ITIM被磷酸化后可募集SHP-2，但不募集SHP-1。
　　2006年，Mayaard研究小組首次發(fā)現(xiàn)了膠原是人LAIR-1的功能性高親和力配體。它們之間的相互作用依賴于保守的甘氨酸-脯氨酸-羥脯氨酸的膠原重復序列。最近，他們又在體外實驗中發(fā)現(xiàn)LAIR-2與LAIR-1有相同的膠原

5、結(jié)合位點，LAIR-2能夠以高親和力結(jié)合膠原，并可阻斷LAIR-1與膠原的結(jié)合。小鼠LAIR-1可以高親和力結(jié)合多種型別的膠原分子，同樣，mLAIR-1與配體的相互作用也依賴于保守的甘氨酸-脯氨酸-羥脯氨酸的膠原重復序列。
　　LAIR-1與膠原之間的相互作用可受到可溶型分子的調(diào)控。sLAIR-1及LAIR-2分子可以阻斷膜型LAIR-1與膜型或細胞外基質(zhì)中的膠原分子結(jié)合。而且LAIR-2與膠原的親和力要遠遠大于sLAIR-1與膠

6、原結(jié)合的親和力，因此，在體內(nèi)LAIR-2很可能作為人膜型LAIR-1受體的競爭分子，從而調(diào)節(jié)LAIR-1的抑制活性。
　　本研究中首先構建了pIg/3C-LAIR-2及pcDNA3.1-LAIR-2真核表達載體，轉(zhuǎn)染CHO細胞，經(jīng)克隆化篩選建立了穩(wěn)定表達LAIR-2-Fc融合蛋白及LAIR-2全長分子的細胞株。利用ProteinA親和層析柱及LAIR-2單克隆抗體交聯(lián)的親和層析柱，從細胞培養(yǎng)上清中分別純化到LAIR-2-Fc融合蛋

7、白及LAIR-2全長分子。為夾心ELISA檢測人標本準備了標準品蛋白。利用流式細胞術及免疫細胞化學技術鑒定了表達的LAIR-2蛋白分子與原核表達LAIR-2抗原制備的單克隆抗體具有良好的結(jié)合活性。
　　應用優(yōu)化的ELISA試劑盒，發(fā)現(xiàn)炎癥病人的血清中可溶型LAIR分子水平高于正常人。孕婦的血清和尿中LAIR-2水平以及尿中的sLAIR-1水平高于對照組。對比實驗發(fā)現(xiàn)，sLAIR-1和LAIR-2之間以及LAIR分子在血清中及尿中的

8、水平都呈正相關。利用免疫組織化學技術，我們用LAIR-1-Fc融合蛋白及LAIR-2-Fc融合蛋白在胎盤組織切片中進行了染色，發(fā)現(xiàn)LAIR-2以高親力結(jié)合胎盤組織基底膜，提示LAIR-2與sLAIR-1一起可能通過與膜型LAIR-1競爭相同的配體來調(diào)節(jié)LAIR-1的免疫抑制功能。
　　應用免疫組織化學及激光共聚焦顯微鏡技術，我們研究了非造血組織中LAIR-1的表達。發(fā)現(xiàn)LAIR-1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)有選擇性表達，而且在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中L

9、AIR-1與小膠質(zhì)細胞標志分子共表達于同一種細胞，同時發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中，小膠質(zhì)細胞的LAIR-1表達水平明顯增高。
　　Toll樣受體是參與固有免疫應答抵抗病原微生物并誘導適應性免疫應答的重要分子。TLR4是識別細菌LPS，介導抗菌炎癥反應的重要分子。它高表達于單核/巨噬細胞、肥大細胞、中性粒細胞以及腸道上皮細胞、內(nèi)皮細胞等。過高水平的LPS在體內(nèi)可誘導嚴重的炎癥反應，甚至發(fā)生敗血癥性休克。目前，對于TLR4介導的信號轉(zhuǎn)導以

10、及生理病理反應的調(diào)節(jié)作用十分關注。為了弄清共表達于單核巨噬細胞表面的LAIR-1與TLR4在功能上的相互關系，我們對LAIR-1調(diào)節(jié)LPS誘導DC細胞產(chǎn)生促炎細胞因子進行了研究。我們首先制備了3株大鼠抗小鼠LAIR-1單克隆抗體并進行了初步鑒定，發(fā)現(xiàn)3株抗體中的FMU-mLAIR-1.2可以用于Westernblot、流式細胞術分析及免疫細胞化學研究。進一步實驗中發(fā)現(xiàn)用固相化的FMU-mLAIR-1.2抗體交聯(lián)小鼠樹突狀細胞系DC2.4