ADAM10在腺癌細(xì)胞中對促凝血相關(guān)因子的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、腫瘤源性血栓形成特指由于明確腫瘤誘因所導(dǎo)致的血栓形成和血栓栓塞。在動脈系統(tǒng)主要表現(xiàn)為腦中風(fēng)和心肌梗死，其發(fā)病率為1.5％～3.1%不等；而靜脈系統(tǒng)受累主要包括深靜脈血栓形成和肺動脈栓塞，發(fā)病率約有15%～20%，同時近5%的腫瘤患者是在進(jìn)行其他項目檢查時意外發(fā)現(xiàn)肺栓塞。腫瘤的發(fā)生部位、類型、分期、分級，及治療方法都會影響腫瘤患者發(fā)生靜脈血栓的發(fā)病率，其中腫瘤類型被認(rèn)為與發(fā)病率的關(guān)系最為密切，大量研究表明肺癌，胰腺癌，胃癌，卵巢癌等腫瘤患

2、者較其他腫瘤患者更容易出現(xiàn)靜脈血栓，其原因多與腺癌細(xì)胞分泌大量黏蛋白等促凝因子相關(guān)。目前，靜脈血栓形成已經(jīng)成為癌癥患者除去原發(fā)腫瘤外的首要死亡原因，是影響腫瘤患者治療和預(yù)后的重要危險因素。由于腫瘤患者同時存在血液高凝狀態(tài)和凝血功能紊亂，同時腫瘤患者體內(nèi)的靜脈血栓除去血液成分以外還摻雜有腫瘤細(xì)胞，因此在接受常規(guī)抗凝治療后，治療效果并不滿意，甚至伴有大出血的風(fēng)險。因而探明腫瘤誘導(dǎo)血栓形成的具體機(jī)制，尋找到新的腫瘤源性靜脈血栓治療方向成為目前

3、的研究熱點。
　　腫瘤誘導(dǎo)血栓形成主要包括兩方面：一是腫瘤細(xì)胞憑借自身的高侵襲性穿過血管內(nèi)皮屏障進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)；二是與血液成分接觸的腫瘤細(xì)胞通過相關(guān)機(jī)制調(diào)節(jié)促凝因子的釋放，在引發(fā)血栓形成的同時隨著血液循環(huán)進(jìn)行遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。目前，腫瘤誘導(dǎo)靜脈血栓形成的研究焦點已不再集中于半胱氨酸蛋白酶對于直接因子Ⅹ的激活，而是轉(zhuǎn)向以組織因子相關(guān)凝血途徑為代表的外源性凝血途徑的激活。腫瘤細(xì)胞表達(dá)的組織因子和粘蛋白被認(rèn)為在血栓形成過程中起到重要促凝作用。

4、組織因子的大量釋放不僅有助于原癌基因的表達(dá)和抑癌基因的抑制，同時還協(xié)助腫瘤血管生成從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲性。
　　去整合素金屬蛋白酶(Adisintegrinandmetalloproteases, ADAMs)是一類具有八個不同結(jié)構(gòu)域的1型跨膜蛋白，因該族蛋白含有金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域和去整合素結(jié)構(gòu)域，因此被認(rèn)為在細(xì)胞分化和遷移過程中對于細(xì)胞因子和粘附分子的釋放起到重要作用。ADAM17因為對腫瘤相關(guān)因子的分泌有促進(jìn)功能因此已經(jīng)在腫瘤

5、細(xì)胞中得到深入研究，與其結(jié)構(gòu)極為相似的ADAM10最初在阿爾茨海默癥的研究中得到廣泛關(guān)注，因此其研究多集中在神經(jīng)和胚胎系統(tǒng)，而在腫瘤領(lǐng)域的研究正逐步展開。本研究將探討在腺癌細(xì)胞系中ADAM10對于腫瘤遷移能力和侵襲性的影響，以及對于相關(guān)促凝血因子分泌的調(diào)節(jié)作用，從而為腫瘤患者靜脈血栓治療新靶點的研究提供理論支持。
　　第一部分 ADAM10對腺癌細(xì)胞遷移力和侵襲性的調(diào)節(jié)
　　目的：為了明確ADAM10在mRNA和蛋白水平的降

6、低是否會引起四種腺癌細(xì)胞的遷移能力和侵襲性發(fā)生相應(yīng)變化。
　　方法：對人非小細(xì)胞肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549，人結(jié)直腸腺癌上皮細(xì)胞系DLD-1，人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和人胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞系PANC-1四種腺癌細(xì)胞進(jìn)行分組設(shè)置，其中進(jìn)行ADAM10小RNA干擾（Small interferingRNA，siRNA）的細(xì)胞為實驗組，未經(jīng)過轉(zhuǎn)染處理的細(xì)胞為對照組。首先使用免疫熒光的方法檢測目的分子在腺癌細(xì)胞中的表達(dá)情況；其次分別使用劃痕實驗檢

7、驗其遷移能力的改變；Transwell實驗檢測其侵襲能力的改變；同時使用實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real timepolymerase chainreaction, Real-TimePCR）和蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）檢測ADAM10，粘蛋白MUC1和VEGFR-2在mRNA和蛋白水平的改變。
　　結(jié)果：在免疫熒光結(jié)果中，四種腺癌細(xì)胞膜表面均可以見到 ADAM10，MUC1和VEGFR-2的表達(dá)。進(jìn)行ADAM1

8、0 siRNA轉(zhuǎn)染后，四種腺癌細(xì)胞實驗組較其對照組在遷移能力和侵襲能力方面均減弱。在mRNA水平，ADAM10在PANC-1中表達(dá)最多，MUC1在MCF-7中表達(dá)最多，VEGFR-2在PANC-1中表達(dá)最多；在蛋白水平，ADAM10在A549中表達(dá)最高，MUC1在MCF-7表達(dá)最高，VEGFR-2在A549中表達(dá)最高。ADAM10, MUC1和VEGFR-2在mRNA和蛋白水平的表達(dá)在實驗組較對照組均有所下降。
　　結(jié)論：ADAM

9、10在 mRNA和蛋白水平的表達(dá)降低能夠引起四種腺癌細(xì)胞的遷移能力和侵襲能力發(fā)生減弱，這種減弱可能與MUC1和VEGFR-2的表達(dá)降低相關(guān)。
　　第二部分 ADAM10對腺癌細(xì)胞促凝血因子釋放的調(diào)節(jié)
　　目的：為了明確ADAM10在mRNA和蛋白水平的降低是否會引起四種腺癌細(xì)胞所分泌的促凝血相關(guān)因子的表達(dá)發(fā)生相應(yīng)變化。
　　方法：將四種腺癌細(xì)胞根據(jù)是否進(jìn)行ADAM10 siRNA轉(zhuǎn)染分為實驗組和對照組。使用免疫熒光的方

10、法檢測目的分子在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)情況；Real-Time PCR和Wsetern Blot方法分別檢測ADAM10，PSGL-1和TF在mRNA和蛋白水平的改變。
　　結(jié)果：在免疫熒光結(jié)果中，四種腺癌細(xì)胞中均可以見到 ADAM10，PSGL-1和 TF在細(xì)胞膜表面表達(dá)。進(jìn)行ADAM10 siRNA轉(zhuǎn)染后，在mRNA水平，ADAM10在PANC-1中表達(dá)最多，PSGL-1在PANC-1中表達(dá)最多，TF在DLD-1中表達(dá)最多；在蛋白水