ADAM10在長(zhǎng)骨發(fā)育障礙和骨肉瘤進(jìn)展中的作用.pdf

1、不同類型細(xì)胞在骨骺區(qū)動(dòng)態(tài)相互作用，通過軟骨內(nèi)骨化的方式促進(jìn)長(zhǎng)骨生長(zhǎng)，骨骺區(qū)還是骨肉瘤好發(fā)部位。其中最常見的細(xì)胞類型為骨骺區(qū)一側(cè)的肥大軟骨細(xì)胞以及另一側(cè)的侵入破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、及血管內(nèi)皮細(xì)胞。目前對(duì)于軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、及破骨細(xì)胞之間的相互調(diào)節(jié)在軟骨內(nèi)骨化中的作用了解較多，但對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞在其中的作用了解甚少。我們此前發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞敲除ADAM10會(huì)導(dǎo)致小鼠長(zhǎng)骨生長(zhǎng)缺陷，但此生長(zhǎng)缺陷的潛在原因并不清楚，此外對(duì)于細(xì)胞表面金屬蛋白酶ADAM1

2、0是否在骨肉瘤中起作用仍不明確。ADAM10是Notch信號(hào)的主要調(diào)節(jié)因子，內(nèi)皮細(xì)胞缺乏ADAM10(ADAM10ΔEC)小鼠視網(wǎng)膜血管結(jié)構(gòu)顯示出特征性的血管分支增加，也是Notch信號(hào)缺陷所特有的現(xiàn)象。大多數(shù)ADAM10ΔEC小鼠可以存活數(shù)月，該動(dòng)物模型因此提供了研究?jī)?nèi)皮細(xì)胞缺乏ADAM10如何影響長(zhǎng)骨生長(zhǎng)的獨(dú)特機(jī)會(huì)。另一方面，近期研究表明Notch信號(hào)通路促進(jìn)骨肉瘤的形成和腫瘤侵襲，提示作為Notch受體主要脫落酶的ADAM10在骨

3、肉瘤的進(jìn)展中可能通過影響腫瘤血管生成起作用。本課題旨在比較ADAM10ΔEC小鼠和對(duì)照小鼠不同發(fā)育階段的長(zhǎng)骨生長(zhǎng)情況，重點(diǎn)研究骨骺區(qū)血管內(nèi)皮細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、及破骨細(xì)胞可能的形態(tài)及分布異常，此外還研究了ADAM10與骨肉瘤進(jìn)展及血管生成的相關(guān)性。
　　第一部分:ADAM10在小鼠長(zhǎng)骨發(fā)育障礙中的作用
　　材料與方法
　　1.內(nèi)皮細(xì)胞ADAM10敲除(ADAM10ΔEC)模型小鼠的建立及鑒定。通過將ADAM10lox/lo

4、x小鼠與表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞特異性Tie2-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠雜交，建立ADAM10內(nèi)皮細(xì)胞敲除小鼠(ADAM10ΔEC，基因型為ADAM10lox/loxTie2-Cre+/-)及正常對(duì)照小鼠(Control，基因型為ADAM10lox/loxTie2-Cre-/-);提取小鼠尾部DNA，PCR法通過檢測(cè)loxP及Tie2產(chǎn)物鑒定小鼠型別(ADAM10ΔEC小鼠或?qū)φ招∈?。
　　2.ADAM10ΔEC小鼠長(zhǎng)骨發(fā)育缺陷的動(dòng)態(tài)改變。采用Fa

5、xitronX射線儀監(jiān)測(cè)ADAM10ΔEC/對(duì)照小鼠不同發(fā)育時(shí)間點(diǎn)多種長(zhǎng)骨發(fā)育缺陷的動(dòng)態(tài)變化，并計(jì)算松質(zhì)骨密度改變;茜素紅-阿辛藍(lán)大體骨-軟骨染色確定敲除ADAM10對(duì)長(zhǎng)骨的骨及軟骨的大體影響;小鼠膝關(guān)節(jié)骨組織切片HE染色、番紅精-固綠軟骨染色，確定股骨及脛骨生長(zhǎng)板區(qū)軟骨代謝及軟骨細(xì)胞改變，并計(jì)算內(nèi)皮細(xì)胞敲除ADAM10后對(duì)生長(zhǎng)板內(nèi)軟骨細(xì)胞增生的影響。
　　3.內(nèi)皮細(xì)胞敲除ADAM10對(duì)小鼠長(zhǎng)骨骨骺區(qū)血管發(fā)育的影響。利用小鼠內(nèi)皮細(xì)

6、胞特異性endomucin抗體行膝關(guān)節(jié)骨組織切片免疫熒光染色，對(duì)比檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞敲除ADAM10后對(duì)股骨骨骺區(qū)血管形態(tài)的改變;通過甲基丙烯酸酯血管鑄型構(gòu)建股骨骨骺區(qū)血管三維模型，研究?jī)?nèi)皮細(xì)胞敲除ADAM10對(duì)小鼠長(zhǎng)骨骨骺區(qū)血管發(fā)育的三維改變。
　　4.ADAM10在小鼠內(nèi)皮細(xì)胞缺失后對(duì)骨骺區(qū)破骨細(xì)胞的影響及與血管異常的聯(lián)系。小鼠膝關(guān)節(jié)骨組織切片TRAP染色，確定內(nèi)皮細(xì)胞缺失ADAM10后骨骺區(qū)破骨細(xì)胞數(shù)目的改變;endomucin-

7、TRAP雙重染色，研究ADAM10內(nèi)皮細(xì)胞敲除后血管發(fā)育異常與破骨細(xì)胞改變的相關(guān)性。
　　5.敲除小鼠內(nèi)皮細(xì)胞ADAM10對(duì)破骨細(xì)胞分化的影響。分離ADAM10ΔEC/對(duì)照小鼠股骨及脛骨骨髓細(xì)胞，體外用巨噬細(xì)胞-擊落刺激因子(M-CSF)分化培養(yǎng)為巨噬細(xì)胞，加入/不加入RANKL繼續(xù)分化為破骨細(xì)胞，TRAP染色確定破骨細(xì)胞數(shù)目及形態(tài)改變。
　　6.小鼠內(nèi)皮細(xì)胞敲除ADAM10對(duì)骨骺區(qū)RANKL/OPG信號(hào)通路的影響。分離AD

8、AM10ΔEC/對(duì)照小鼠上下肢骨骺區(qū)軟骨并提取RNA，實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(realtimequantitativeRT-PCR)mRNA水平檢測(cè)RANKL/OPG比值改變，以確定RANKL/OPG信號(hào)通路對(duì)ADAM10內(nèi)皮細(xì)胞敲除引起的破骨細(xì)胞改變的影響。
　　結(jié)果
　　1.ADAM10內(nèi)皮細(xì)胞敲除導(dǎo)致小鼠多個(gè)長(zhǎng)骨發(fā)育障礙。FaxitronX線攝片長(zhǎng)度測(cè)量分析顯示，小鼠內(nèi)皮細(xì)胞缺失ADAM10導(dǎo)致股骨及脛骨最早于生后7天明

9、顯短縮(P7)，其中股骨短縮隨時(shí)間進(jìn)展明顯加重，肱骨、尺骨、橈骨于生后14天開始明顯短縮，而上肢掌骨在所有監(jiān)測(cè)時(shí)間點(diǎn)(P7-P183)均無明顯短縮;骨密度分析顯示ADAM10ΔEC小鼠股骨及脛骨生長(zhǎng)板下骨松質(zhì)密度均顯著增高，分別始于P28及P21。
　　2.ADAM10敲除導(dǎo)致長(zhǎng)骨生長(zhǎng)板結(jié)構(gòu)異常。小鼠膝關(guān)節(jié)骨組織切片HE染色顯示，與對(duì)照小鼠相比ADAM10ΔEC小鼠股骨生長(zhǎng)板生后7天及14天未見明顯異常，生長(zhǎng)板后方在生后21天則開

10、始出現(xiàn)不連續(xù)，至生后28天生長(zhǎng)板后方進(jìn)展為局部中斷，而生長(zhǎng)板前方肥大軟骨細(xì)胞層則表現(xiàn)為不規(guī)則增厚，此外HE染色還顯示骨松質(zhì)密度增加導(dǎo)致ADAM10ΔEC小鼠股骨髓腔較對(duì)照小鼠明顯變窄，生后42天出現(xiàn)整個(gè)生長(zhǎng)板區(qū)多個(gè)部位顯著中斷;ADAM10ΔEC小鼠脛骨生長(zhǎng)板于生后14天開始出現(xiàn)不同于股骨生長(zhǎng)板改變的中央型肥大軟骨細(xì)胞層明顯增厚，一直持續(xù)至監(jiān)測(cè)到的生后42天，并導(dǎo)致生長(zhǎng)板下骨缺損。番紅精-固綠軟骨染色顯示生后21天ADAM10ΔEC小鼠

11、股骨及脛骨生長(zhǎng)板增生軟骨細(xì)胞層開始出現(xiàn)軟骨合成減少。茜素紅-阿辛藍(lán)全組織染色顯示ADAM10ΔEC小鼠生后42天股骨遠(yuǎn)端骨骺線出現(xiàn)早閉。
　　3.小鼠內(nèi)皮細(xì)胞中缺失ADAM10導(dǎo)致骨骺區(qū)血管發(fā)育紊亂。免疫熒光染色顯示ADAM10ΔEC小鼠股骨骨骺區(qū)于生后14天出現(xiàn)endomucin熒光抗體顯著增強(qiáng)，分析顯示骨骺區(qū)血管密度顯著增加，生后21天生長(zhǎng)板中斷處證實(shí)有血管侵入，至28天生長(zhǎng)板被貫穿處上下側(cè)均發(fā)現(xiàn)有血管侵入，脛骨骨骺區(qū)則出現(xiàn)襻

12、樣血管團(tuán)，或于增厚的生長(zhǎng)板下方出現(xiàn)血管缺失;相較ADAM10ΔEC小鼠而言，對(duì)照小鼠骨骺區(qū)血管分布規(guī)則、均勻，且endomucin熒光染色較淺;甲基丙烯酸酯血管鑄型解剖顯微鏡下顯示對(duì)照小鼠股骨血管為單個(gè)大的中央動(dòng)脈延伸至骨骺區(qū)分支為逐漸增多的規(guī)則、平行、細(xì)小的血管環(huán)，而ADAM10ΔEC小鼠股骨血管鑄型則顯示骨骺區(qū)血管分布雜亂、交錯(cuò)，以及多處小的血管球樣擴(kuò)張。
　　4.ADAM10ΔEC小鼠長(zhǎng)骨發(fā)育障礙由骨骺區(qū)破骨細(xì)胞數(shù)目明顯減少

13、引起。TRAP染色顯示在ADAM10ΔEC小鼠股骨骨骺區(qū)，生后7天及14天破骨細(xì)胞數(shù)目及分布較對(duì)照小鼠無明顯改變，生后21天破骨細(xì)胞數(shù)目開始出現(xiàn)顯著減少直至28天，脛骨骨骺區(qū)破骨細(xì)胞變化與股骨類似。
　　5.ADAM10內(nèi)皮細(xì)胞缺失引起的骨骺區(qū)破骨細(xì)胞數(shù)目減少與血管發(fā)育紊亂密切相關(guān)。Endomucin-TRAP雙重染色顯示，生后14天及28天股骨骨骺區(qū)TRAP+破骨細(xì)胞與endomucin+內(nèi)皮細(xì)胞在空間位置上緊密聯(lián)系，14天血管

14、密度明顯增加而破骨細(xì)胞數(shù)目未見明顯減少;28天同樣可見相似的血管密度增加，但股骨骨骺區(qū)破骨細(xì)胞數(shù)目則顯著減少。
　　6.內(nèi)皮細(xì)胞缺失ADAM10導(dǎo)致小鼠體外破骨細(xì)胞分化能力下降，但RANKL/OPG信號(hào)通路未受影響。體外破骨細(xì)胞細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)表明ADAM10ΔEC小鼠來源于股骨及脛骨的骨髓細(xì)胞破骨細(xì)胞生成較對(duì)照小鼠稍延遲，導(dǎo)致TRAP+破骨細(xì)胞數(shù)目出現(xiàn)少量但統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的減少，而來源于小鼠上下肢骨骺區(qū)組織的定量PCR結(jié)果顯示ADAM1

15、0ΔEC小鼠與對(duì)照小鼠RANKL/OPG比值無顯著性差異。
　　第二部分:ADAM10在骨肉瘤進(jìn)展中的作用
　　材料與方法
　　1.骨肉瘤樣本。主要樣本來源于購買的組織芯片，每張包含40例人骨肉瘤組織塊（多聚甲醛處理，石蠟包埋）病理分期從ⅠA至ⅡB期，組織類型包括:骨母細(xì)胞型骨肉瘤、軟骨母細(xì)胞型骨肉瘤、纖維母細(xì)胞型骨肉瘤、以及富含巨細(xì)胞骨肉瘤;部分石蠟包埋組織來源于本院病理科。
　　2.常規(guī)HE染色。確定腫瘤組織

16、來源、形態(tài)、及病理類型。
　　3.免疫熒光染色?？笴D31、抗胞內(nèi)ADAM10、抗胞內(nèi)段/活化Notch1(Notch1intracellulardomain，NICD)，DAPI(胞核染色)，免疫熒光染色骨肉瘤組織切片，并計(jì)算CD31、NICD表達(dá)強(qiáng)度，血管分支數(shù)目及ADAM10陽性細(xì)胞數(shù)目與腫瘤分期及組織類型的相關(guān)性;雙重免疫熒光染色(CD31/ADAM10，CD31/NICD)研究ADAM10/Notch1表達(dá)與腫瘤血管內(nèi)皮

17、細(xì)胞之間的關(guān)系。
　　4.TRAP染色。確定破骨細(xì)胞在骨肉瘤組織中的表達(dá)情況，并明確富含巨細(xì)胞骨肉瘤中的破骨細(xì)胞樣多核巨細(xì)胞是否為破骨細(xì)胞。
　　結(jié)果
　　1.ADAM10在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)與骨肉瘤的進(jìn)展呈正相關(guān)。在所有骨肉瘤分期及病例中均發(fā)現(xiàn)有ADAM10局部聚集表達(dá)于骨肉瘤細(xì)胞中，隨著骨肉瘤從ⅠA期進(jìn)展為ⅡB期，ADAM10+腫瘤細(xì)胞數(shù)目也顯著增加，ⅡA和ⅡB期的ADAM10+腫瘤細(xì)胞數(shù)目平均值較ⅠA期顯著升高;此

18、外骨母細(xì)胞型骨肉瘤中ADAM10+腫瘤細(xì)胞也顯著多于軟骨母細(xì)胞型骨肉瘤及纖維母細(xì)胞型骨肉瘤。
　　2.ⅠA/ⅠB期骨肉瘤存在一類血管原性腫瘤細(xì)胞，可能通過“胞質(zhì)內(nèi)陷”方式形成血管管腔。HE染色發(fā)現(xiàn)ⅠA/ⅠB期骨肉瘤中存在一類嗜堿性圓形腫瘤細(xì)胞，CD31染色呈陽性，證明其為血管原性，其中部分腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)不同階段的“胞質(zhì)內(nèi)陷”，可能為形成血管管腔的一種機(jī)制，同時(shí)ADAM10也均一表達(dá)于這類細(xì)胞胞質(zhì)中。
　　3.富含巨細(xì)胞骨肉瘤中

19、的破骨細(xì)胞樣多核巨細(xì)胞并非破骨細(xì)胞，而是血管原性腫瘤細(xì)胞，涉及ADAM10/Notch1信號(hào)活化。TRAP/DAPI雙重染色證明富含巨細(xì)胞骨肉瘤中的多核巨細(xì)胞TRAP染色陰性，而骨母細(xì)胞型骨肉瘤、軟骨母細(xì)胞型骨肉瘤及纖維母細(xì)胞型骨肉瘤中均含TRAP+腫瘤細(xì)胞。CD31以中度水平均一表達(dá)于巨細(xì)胞胞質(zhì)中，ADAM10和活化的Notch1也共同表達(dá)于巨細(xì)胞中，其表達(dá)模式與CD31類似。
　　4.部分骨肉瘤血管結(jié)構(gòu)內(nèi)皮缺失。CD31染色發(fā)

20、現(xiàn)ⅠA期-ⅡB期部分骨肉瘤血管結(jié)構(gòu)中紅細(xì)胞未被血管內(nèi)皮包繞，但血管內(nèi)皮CD31染色陽性，證明其中并非由于血管內(nèi)皮不表達(dá)CD31而是因?yàn)檠軆?nèi)皮缺失造成，其形成可能與多核巨細(xì)胞相關(guān)。
　　結(jié)論
　　1.生長(zhǎng)板區(qū)血管在調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞僅在諸如股骨、肱骨、脛骨、尺骨、以及橈骨這些較大長(zhǎng)骨的發(fā)育后期顯現(xiàn)出作用。
　　2.內(nèi)皮細(xì)胞中ADAM10對(duì)于長(zhǎng)骨中特化的血管在軟骨內(nèi)骨化中的正常發(fā)育及功能是必需的。
　　3.ADAM10Δ

21、EC小鼠長(zhǎng)骨骨骺區(qū)破骨細(xì)胞數(shù)目的減少很有可能是由ADAM10缺乏導(dǎo)致Notch信號(hào)異常，引起血管內(nèi)皮細(xì)胞分化障礙，導(dǎo)致血管結(jié)構(gòu)異常造成的，而不是由ADAM10缺乏導(dǎo)致血管內(nèi)皮釋放RANKL等可溶性因子缺陷造成的。
　　4.ADAM10在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)與骨肉瘤進(jìn)展正相關(guān)。
　　5.ⅠA/ⅠB期骨肉瘤中存在一類血管原性腫瘤細(xì)胞，可能通過“胞質(zhì)內(nèi)陷”形成血管管腔，ADAM10參與其中。
　　6.富含巨細(xì)胞骨肉瘤中破骨細(xì)胞樣