造血發(fā)育相關(guān)因子對小鼠AGM區(qū)血液血管干細胞的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、血液血管干細胞（hemangioblast）是一種具有雙向分化潛能的干細胞，在體內(nèi)外發(fā)育的過程中，能夠分化成為造血細胞和內(nèi)皮細胞。血液血管干細理論已經(jīng)通過在胚胎干細胞分化模型中得到驗證，即胚胎干細胞經(jīng)2.5-3.5天分化為擬胚體，再在特殊的分化體系中可以形成一種特殊的Blast樣集落，其具有同時分化產(chǎn)生內(nèi)皮細胞和造血細胞的能力，這種形成Blast樣集落的細胞被稱為BL-CFC（the blast colony-forming cell）

2、。近年來，血液血管干細胞在起源、分子生物學(xué)特點、體外誘導(dǎo)分化等方面的研究取得了較大進展。既往研究發(fā)現(xiàn)小鼠胚胎定向造血的起源部位AGM區(qū)亦存在類似血液血管干細胞的前體HPP-HA。之后在小鼠胚胎AGM區(qū)同樣發(fā)現(xiàn)了BL-CFC的存在，建立了特殊的的血液血管干細胞模型，此模型已被應(yīng)用于研究小鼠AGM區(qū)血液血管干細胞的發(fā)育和調(diào)控，如經(jīng)典的造血生長因子IL-3也可以促進血液血管干細胞的發(fā)育和分化。然而，鑒于血清培養(yǎng)體系營養(yǎng)成分復(fù)雜，不利于精細研究

3、某些細胞因子對血液血管干細胞的真實作用。因此，本研究在小鼠胚胎AGM區(qū)已建立的BL-CFC模型的基礎(chǔ)上，建立了一個BL-CFC的無血清孵育培養(yǎng)模型，優(yōu)化了常規(guī)的BL-CFC培養(yǎng)體系，并在此基礎(chǔ)上，研究造血發(fā)育相關(guān)因子對小鼠AGM區(qū)血液血管干細胞的調(diào)節(jié)作用。
　　 本研究首先在小鼠胚胎AGM區(qū)建立了BL-CFC的無血清孵育培養(yǎng)模型。取E10.5小鼠胚胎AGM區(qū)，消化成單細胞，在無血清培養(yǎng)體系下孵育12h后進行半固體集落培養(yǎng)。在bF

4、GF、SCF、VEGF、IL-6、IGF-I和LIF細胞生長因子的共同作用下培養(yǎng)3-3.5天后，可見一種特殊形態(tài)的集落開始出現(xiàn)，其形態(tài)和分化特征與E9.5-12.5小鼠胚胎AGM區(qū)來源的Blast集落相似。然后進行BL-CFC造血及內(nèi)皮分化功能鑒定。集落培養(yǎng)4-5天后，挑取單個集落進行造血集落培養(yǎng)。所有的BL-CFC可產(chǎn)生CFU-E、CFU-GM、CFU-Mix等一種或多種造血集落。貼壁細胞換EGM2內(nèi)皮細胞完全培養(yǎng)基繼續(xù)進行誘導(dǎo)，第7

5、-10天時可見貼壁細胞中有大量鵝卵石樣內(nèi)皮細胞以及少量成熟的造血細胞。隨后進行體外成血管功能檢測，結(jié)果表明：貼壁細胞高比例的吞噬LDL；體外Matrigel上可形成血管樣結(jié)構(gòu)，呈網(wǎng)絡(luò)狀生長。同時，將BL-CFC在OP9基質(zhì)細胞上進行造血和內(nèi)皮細胞分化功能檢測。挑取單個Blast集落，接種于OP9基質(zhì)細胞上培養(yǎng)7-10天后，所有集落在OP9上均顯示造血細胞的分化潛能（CD45陽性），30％的HA在OP9上可以形成CD31陽性的管樣結(jié)構(gòu)。<

6、br>　　 接下來，研究了三種與造血發(fā)育相關(guān)的細胞因子IL-3、SCF和NGF對小鼠胚胎AGM區(qū)細胞的調(diào)節(jié)作用。將上述3種細胞因子與AGM區(qū)細胞分別在SR及FBS體系下體外共孵育12小時后進行BL-CFC接種，結(jié)果顯示IL-3在兩種體系下均能擴增BL-CFC，而NGF在兩種體系下對BL-CFC均無作用，SCF只在SR體系中對BL-CFC有明顯的擴增作用。
　　 綜上，本研究在小鼠胚胎AGM區(qū)建立了BL-CFC的無血清孵育培養(yǎng)模