N-甲基-D天冬氨酸受體2B亞基鎮(zhèn)痛疫苗的構(gòu)建及其鎮(zhèn)痛效應(yīng)的研究.pdf

1、研究背景：
　　 本研究旨在首先觀察NR2B 多肽疫苗對神經(jīng)病理性痛大鼠的免疫效應(yīng)及鎮(zhèn)痛效應(yīng)，然后構(gòu)建NR2B重組腺病毒鎮(zhèn)痛疫苗，并通過口服免疫大鼠，以評價其對大鼠神經(jīng)病理性痛痛感覺和痛情緒的影響。
　　 研究方法與結(jié)果：1、NR2B 多肽疫苗對神經(jīng)病理性痛大鼠的免疫效應(yīng)及超前鎮(zhèn)痛效應(yīng)
　　 方法：選取NR2B 有免疫原性的一段氨基酸序列合成多肽，并與大分子蛋白載體匙孔蟲戚血藍(lán)蛋白交聯(lián)制備NR2B 多肽疫苗即NR

2、2B-KLH。健康雌性SD大鼠隨機(jī)分為三組：PBS組、KLH組及NR2B組。分別用PBS＋福氏佐劑，KLH＋福氏佐劑和NR2B-KLH＋福氏佐劑皮下注射三次，每次注射后兩周以間接ELISA 法檢測受免大鼠血清NR2B 特異性抗體的滴度，并以免疫組化染色法檢測大鼠免疫血清與脊髓背角NR2B蛋白的免疫結(jié)合反應(yīng)。于第三次免疫后一周結(jié)扎坐骨神經(jīng)的脛神經(jīng)和腓總神經(jīng)分支，保留腓腸神經(jīng)分支，建立SD大鼠保留神經(jīng)損傷性神經(jīng)病理性痛模型。術(shù)后隔日以up-

3、down 法檢測大鼠術(shù)側(cè)后爪50％機(jī)械縮爪閾值的變化及熱痛縮爪時間的變化。分別于術(shù)前一天和術(shù)后7天經(jīng)枕骨大孔取腦脊液10～20μl，以間接ELISA法檢測CSF 中NR2B 抗體滴度。術(shù)后7天處死大鼠，取腰段脊髓，以免疫組化染色法檢測脊髓背角c-Fos 陽性神經(jīng)元數(shù)目，并采用Western blotting 法檢測脊髓背角NR2B蛋白的改變。
　　 結(jié)果：免疫組化染色法檢測發(fā)現(xiàn)NR2B大鼠血清可與大鼠脊髓背角結(jié)合呈陽性著色，而其

4、余兩組未見著色。與術(shù)前比較，術(shù)后第7天PBS、KLH 及NR2B 各組50％縮爪閾值均明顯降低；但各組間比較，NR2B組明顯高于其余兩對照組。各組術(shù)后7天熱痛縮爪時間與術(shù)前比較均有顯著升高，但各組間比較，NR2B組明顯低于其余兩對照組。術(shù)后7天脊髓背角c-Fos蛋白陽性神經(jīng)元的數(shù)目NR2B組明顯低于兩對照組.術(shù)前NR2B組大鼠腦脊液中NR2B 抗體呈陰性，而術(shù)后7天呈陽性，而PBS組和KLH組這兩個時間點均為陰性。Western blo

5、tting 法檢測發(fā)現(xiàn)術(shù)后7天NR2B組脊髓背角NR2B蛋白的表達(dá)較其余兩組明顯降低。
　　 2、NR2B 多肽疫苗對已發(fā)生的大鼠神經(jīng)病理性痛的鎮(zhèn)痛作用
　　 方法：選取雌性SD大鼠根據(jù)第一部分的方法制作SNI 模型，術(shù)后每天檢測術(shù)側(cè)后爪50％機(jī)械縮爪閾值的改變。術(shù)后7天選取50％機(jī)械縮爪閾值與術(shù)前比較顯著降低的大鼠18 只隨機(jī)分為三組：PBS組、KLH組及NR2B組，按照第一部分的免疫方法皮下免疫三次。第三次免疫后14

6、天比較各組大鼠50％機(jī)械縮爪閾值、熱痛縮爪時間等改變；處死大鼠取血清，以間接ELISA 方法檢測血清NR2B 抗體滴度，取腰段脊髓以免疫組化方法分析脊髓背角GFAP蛋白的表達(dá)及星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活狀況。提取大鼠腰段脊髓總蛋白以western blotting檢測NR2B蛋白表達(dá)的改變。
　　 結(jié)果：經(jīng)過三次免疫，在第三次免疫后14天NR2B組大鼠血清NR2B 抗體的滴度為6.9±2.0μg/ml，而PBS組及KLH組未檢測到NR2

7、B 抗體。SNI 術(shù)后第7天，PBS、KLH 及NR2B 各組大鼠50％縮爪閾值分別為2.5±1.4、2.4±0.9 及2.0±0.6 (g)，而術(shù)前分別為13.0±1.9、11.7±2.2 及12.6±2.7 (g)，較術(shù)前明顯降低，但各組間比較無統(tǒng)計學(xué)差異。在第三次免疫后14天，NR2B組大鼠50％縮爪閾值為6.8±1.5 (g)，而PBS組為3.2±1.3 (g)，KLH組為3.7±1.4 (g)，NR2B組明顯高于兩對照組。術(shù)后

8、第7天，PBS、KLH、NR2B 各組大鼠熱痛縮爪時間分別為9.4±1.9、7.8±2.4和8.2±1.9 (S)，而術(shù)前各組分別為2.4±1.0、3.4±1.2、2.2±0.9 (S)，較術(shù)前明顯升高，但各組間比較無統(tǒng)計學(xué)差異。在第三次免疫后14天，各組熱痛縮爪時間三組分別為7.9±1.6、7.3±1.9、4.6±1.2 (S)，NR2B組明顯低于對照組。第三次免疫后14天NR2B組脊髓背角Ⅰ～Ⅱ星形膠質(zhì)細(xì)胞激活狀況明顯低于對照組。<

9、br>　　 3、NR2B 重組腺病毒鎮(zhèn)痛疫苗的構(gòu)建
　　 方法：以限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切質(zhì)粒pcDNA3.1-NR2B 獲得目的基因NR2B；將NR2B 定向克隆入腺病毒穿梭載體pDC515，并行酶切及DNA 測序鑒定。
　　 結(jié)果：感染病毒rAd5/NR2B的293 細(xì)胞有180kDa的蛋白條帶，而未感染該病毒的293 細(xì)胞無此蛋白條帶。rAd5/NR2B 經(jīng)大量擴(kuò)增及純化，病毒滴度為5×1011

10、(V.P./ml)，經(jīng)HPLC 法分析純度為100％。
　　 4、NR2B 重組腺病毒疫苗口服免疫對大鼠神經(jīng)病理性痛的超前鎮(zhèn)痛效應(yīng)
　　 方法：rAd5/NR2B(1×108 PFU)口服免疫大鼠，2周后以相同劑量加強(qiáng)免疫一次，空白組和rAd5/EGFP組大鼠分別以PBS和rAd5/EGFP 以同樣的劑量和同樣的方法免疫作為對照，每組16 只。初次免疫后1周取4 只大鼠處死，取大鼠近段小腸集合淋巴結(jié)組織，提取該組織RNA

11、 以RT-PCR 方法檢測NR2B的表達(dá)。分別于免疫后2、4、6、8、10、15周截尾法取血0.5～1.0ml 離心取血清檢測免疫血清NR2B 抗體的滴度。
　　 結(jié)果：大鼠經(jīng)疫苗rAd5/NR2B 口服免疫1周后，提取近段小腸集合淋巴結(jié)組織RNA，經(jīng)RT-PCR 反應(yīng)可見600bp大小的NR2B 特異性DNA 條帶，而空白組和rAd5/EGFP組無此條帶。
　　 5、NR2B 重組腺病毒疫苗口服免疫對神經(jīng)病理性大鼠痛情

12、緒反應(yīng)的影響
　　 方法：通過位置偏愛實驗，選取24只無位置偏愛的SD大鼠，隨機(jī)分為三組：空白對照組、rAd5/EGF組以及rAd5/NR2B組，每組8只。rAd5/NR2B口服免疫，劑量1×108PFU，2周后以同樣劑量加強(qiáng)免疫一次，此為rAd5/NR2B組。而對照組分別以PBS和rAd5/EGFP，按照同樣的劑量和方法免疫。加強(qiáng)免疫后2周，截尾法取血0.5～1.0ml并離心取血清，ELISA法檢測血清NR2B抗體的滴度。結(jié)扎

13、脛神經(jīng)和腓總神經(jīng)，保留腓腸神經(jīng)，制作SNI模型。SNI術(shù)后7天將大鼠放入位置回避箱內(nèi)進(jìn)行SNI條件性位置回避實驗。該實驗分為預(yù)處理期1天，訓(xùn)練期4天和測試期1天，三個階段，觀察并記錄大鼠在位置回避箱內(nèi)停留時間。分別于SNI術(shù)前一天和實驗結(jié)束時經(jīng)側(cè)腦室取CSF20μl左右，分別以ELISA法和western blotting檢測其中NR2B 抗體滴度和CSF中NR2B抗體與前腦ACC神經(jīng)元膜蛋白的自身免疫反應(yīng)。實驗結(jié)束處死大鼠取前腦ACC

14、組織，分別以免疫組化方法和western blotting檢測前腦ACC組織NR2B蛋白的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：加強(qiáng)免疫后2周，rAd5/NR2B組免疫血清NR2B 抗體滴度為13.5±2.3μg/ml，而空白對照組和rAd5/EGFP組血清未檢測到NR2B 抗體。SNI條件性位置回避時間空白組、rAd5/EGFP組以及rAd5/NR2B組分別為198±49，237±40和138±29(S)，rAd5/NR2B組與對照組比較明

15、顯降低。CSF 中NR2B 抗體滴度檢測顯示，rAd5/NR2B組在SNI前為陰性，而SNI 術(shù)后為抗體陽性，而對照組為陰性。Western blotting 結(jié)果表明rAd5/NR2B組CSF 可與前腦ACC 神經(jīng)元膜蛋白提取物呈特異性結(jié)合反應(yīng)，而空白對照組和rAd5/EGFP組未見特異性結(jié)合反應(yīng)。ACC組織免疫組化及western blotting結(jié)果表明，rAd5/NR2B組大鼠前腦ACC 神經(jīng)元NR2B蛋白的表達(dá)較空白對照組和r

16、Ad5/EGFP組明顯降低。
　　 6、統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS12.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±S)表示，組內(nèi)、組間比較采用單因素方差分析；計數(shù)資料以率表示，組間比較采用卡方檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 研究結(jié)論：
　　 NR2B 多肽疫苗皮下三次免疫可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對NR2B的體液性免疫性應(yīng)答，血清內(nèi)檢測到NR2B 抗體。在神經(jīng)病理性痛時，該抗體可進(jìn)入脊髓背角與NR2B蛋白結(jié)

17、合，下調(diào)NR2B蛋白的表達(dá)，對神經(jīng)病理性痛產(chǎn)生超前鎮(zhèn)痛作用。對已存在的神經(jīng)病理性痛，該疫苗皮下免疫也可減輕痛覺過敏。
　　 將NR2B基因插入腺病毒載體，成功構(gòu)建NR2B 重組腺病毒疫苗rAd5/NR2B。該疫苗口服免疫可誘導(dǎo)產(chǎn)生高滴度的NR2B 抗體，其滴度和持續(xù)時間優(yōu)于多肽疫苗。
　　 rAd5/NR2B 疫苗口服免疫不但對神經(jīng)病理性痛痛感覺產(chǎn)生超前鎮(zhèn)痛作用，而且對神經(jīng)病理性痛伴隨的痛情緒反應(yīng)也有抑制作用。