突觸外N-甲基-D-天冬氨酸受體在成年小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元長時程增強(qiáng)中的作用.pdf

1、突觸是神經(jīng)元之間相互聯(lián)系，傳遞各種生物電信號、化學(xué)信號的關(guān)鍵部位。NMDA受體(N-methyl-D-aspartate receptors，NMDA受體)是哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)中重要的離子通道型谷氨酸受體。根據(jù)其在細(xì)胞膜表面的分布特點(diǎn)，可分為突觸內(nèi)及突觸外NMDA受體。但是，由于選擇性分離突觸內(nèi)及突觸外NMDA受體在技術(shù)上存在一定難度，一直以來學(xué)者們無法對分布在細(xì)胞膜表面不同區(qū)域的NMDA受體群的功能進(jìn)行研究。2002年Hardingha

2、m等人首次在培養(yǎng)的神經(jīng)元上選擇性地分離突觸外NMDA受體，發(fā)現(xiàn)突觸內(nèi)NMDA受體與突觸外NMDA受體對環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP responseelement binding protein，CREB)基因表達(dá)調(diào)控，細(xì)胞內(nèi)信號途徑以及細(xì)胞的生長與死亡上具有相反的作用。鈣離子經(jīng)激活的突觸內(nèi)NMDA受體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，可誘導(dǎo)CREB水平上調(diào)，腦源性神經(jīng)生長因子（brain-derived neurotrophicfactor，BDN

3、F）表達(dá)增加，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生長;反之，突觸外NMDA受體激活后下調(diào)CREB水平，使得BDNF表達(dá)降低，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。但是，關(guān)于突觸外NMDA受體在長時程增強(qiáng)(long-term potentiation，LTP)中的作用仍然未見有研究報道。
　　在本研究中，我們從三個方面研究了成年小鼠海馬切片的CA1區(qū)突觸外NMDA受體在長時程增強(qiáng)中的作用:
　　1應(yīng)用膜片鉗記錄技術(shù)及場電位記錄技術(shù)建立成年小鼠海馬切片上選擇性記錄突觸內(nèi)、外

4、NMDA受體介導(dǎo)的電流或者電壓的方法;
　　2闡明突觸外NMDA受體對LTP形成的作用;
　　3研究突觸內(nèi)、外不同NMDA受體亞單位對LTP誘導(dǎo)的作用。
　　主要的方法及結(jié)果:
　　1選擇性記錄突觸內(nèi)、外NMDA受體介導(dǎo)的膜片鉗全細(xì)胞電流:
　　(1)制作7～8周健康雄性C57BL/6J小鼠的急性海馬切片（厚度400微米）。
　　(2)選取海馬CA1區(qū)，表面光滑、立體感強(qiáng)的錐體神經(jīng)元進(jìn)行紅外線可視全細(xì)

5、胞膜片鉗記錄，灌流非NMDA受體阻斷劑6-氰基-7-硝基喹喔啉-2，3-二酮(CNQX)以及伽馬氨基丁酸A(GABAA)受體阻斷劑木防己苦毒素(picrotoxin)，在電壓鉗模式下將錐體神經(jīng)元鉗制在+40 mV，針對CA1區(qū)Schaffer Collateral-Commissural纖維每隔15 see給予一次電刺激，記錄突觸內(nèi)NMDA受體介導(dǎo)的興奮性突觸后電流(excitatory postsynaptic current, EP

6、SC)。
　　(3)灌流NMDA受體的非競爭性及不可逆性阻斷劑MK-801(20μM），20分鐘后給予5 Hz/16 sec的低頻刺激，阻斷突觸內(nèi)NMDA-EPSC。
　　(4)洗脫MK-801，30分鐘后給予短串高頻刺激(100 Hz，100msec)，記錄突觸外NMDA受體介導(dǎo)的EPSC。
　　2突觸內(nèi)、外NMDA受體在長時程可塑性中的作用:
　　在場電位記錄模式下記錄海馬切片CA1區(qū)興奮性突觸后電位（exc

7、itatory postsynaptic potential，EPSP），灌流MK-801二十分鐘，然后給予5 Hz/16 sec刺激阻斷突觸內(nèi)NMDA受體，洗脫MK-801，30～50分鐘后，給予3次高頻強(qiáng)直刺激（100 Hz/1 sec，15秒間隔）激活突觸外NMDA受體，60分鐘后檢測LTP的形成，結(jié)果發(fā)現(xiàn)沒有LTP形成。
　　在場電位記錄模式下，單純給予5Hz低頻刺激激活突觸內(nèi)NMDA受體，沒有誘導(dǎo)LTP形成。
　　

8、3不同NMDA受體亞單位的作用:
　　利用NR2A或者NR2B亞單位的阻斷劑研究不同NMDA受體亞單位對LTP形成的影響。阻斷NR2B亞單位后，無論是選擇性激活突觸外NMDA受體還是選擇性激活突觸內(nèi)NMDA受體，均可以誘導(dǎo)出LTP;而阻斷NR2A亞單位后，不論是選擇性激活突觸外NMDA受體，還是選擇性激活突觸內(nèi)NMDA受體，均不能誘導(dǎo)出LTP。
　　主要結(jié)論:
　　1)無論是在突觸外還是在突觸內(nèi)，NR2B亞單位都負(fù)向調(diào)