辛代他汀對原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞DDAH1不同轉(zhuǎn)錄本表達的影響及機制研究.pdf

1、目的:
　　ADMA是心血管疾病的風(fēng)險因素，其主要代謝酶DDAH1被認(rèn)為是心血管疾病治療的重要靶點。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)人類DDAH1存在3個轉(zhuǎn)錄本，但只有其中DDAH1-V1與ADMA代謝相關(guān)。本文旨在研究辛伐他汀對DDAH1的三個不同轉(zhuǎn)錄mRNA表達的影響及其機制，為探討DDAH1不同轉(zhuǎn)錄本在辛伐他汀反應(yīng)性及不同轉(zhuǎn)錄本的功能奠定基礎(chǔ)。
　　方法:
　　(1) Transwell小室實驗測定辛伐他汀對ADMA處理的

2、臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞遷移的影響:細(xì)胞分為DMSO（對照）組、ADMA(3μM)處理組、ADMA（3μM）+辛伐他汀(1μM)處理組和辛伐他汀(1μM)處理組。細(xì)胞應(yīng)用DMSO（對照組）或ADMA(3μM)處理24h，ADMA(3μM)+辛伐他汀（1μM）處理組和辛伐他?。?μM）處理組先用1μM辛伐他汀預(yù)處理6h，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至Transwell小室上室，24h后測定小室對側(cè)遷移的細(xì)胞數(shù)目，以評估內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力。
　　(2)觀察辛伐他汀

3、對原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞DDAH1轉(zhuǎn)錄本表達的影響:原代培養(yǎng)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分別應(yīng)用DMSO(溶劑對照組)或低、中、高濃度(0.2μM、1μM、2μM)的辛伐他汀處理12h和24h，提取總RNA和總蛋白，采用Real-time PCR的方法檢測DDAH1的三個轉(zhuǎn)錄本mRNA表達，western-blot檢測DDAH1-V1蛋白表達。
　　(3)觀察辛伐他汀對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞DDAH1轉(zhuǎn)錄本mRNA穩(wěn)定型的影響:人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株分

4、別加用（處理組）或不加（對照組）辛伐他汀（1μM、2μM）預(yù)處理2h后，加入放線菌素D(ActD，2.5μg/ml）進行處理，并在加入ActD后0h、1h、2h、4h、8h和12h收集細(xì)胞，提取總RNA，采用Real-time PCR法檢測DDAH1的三個轉(zhuǎn)錄本mRNA的表達。
　　結(jié)果:
　　(1)與對照組相比，3μM ADMA處理可顯著促進內(nèi)皮細(xì)胞遷移（1.30±0.30 vs1±0.00，P=0.012），中濃度的辛伐

5、他汀單獨處理對內(nèi)皮細(xì)胞遷移無顯著影響。與ADMA處理組相比較，中濃度辛伐他汀+ADMA組細(xì)胞遷移比顯著下降（0.94±0.086 vs1.30±0.30，P=0.011）。
　　(2)與DMSO組相比，低、中、高濃度的辛伐他汀對DDAH1轉(zhuǎn)錄本1(DDAH1-V1)mRNA表達均無顯著影響;中、高濃度的辛伐他汀呈濃度依賴性地下調(diào)DDAH1轉(zhuǎn)本2(DDAH1-V2)mRNA表達(0.52±0.24 vs0.89±0.23，P=0.0

6、44和0.38±0.19 vs0.89±0.23，P=0.0093)和轉(zhuǎn)錄本3(DDAH1-V3)的mRNA表達（0.59±0.19 vs0.86±0.05，P=0.028和0.40±0.15 vs0.86±0.05，P=0.0013）。
　　(3)與DMSO相比，低、中、高三個濃度的辛伐他汀處理12h呈濃度依賴性地上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)DDAH1-V1蛋白表達（低濃度:1.35±0.16 vs1±0.00，P=0.03;中濃度:1.90

7、±0.29 vs1±0.00，P=0.00014;高濃度:1.95±0.04 vs1±0.00，P=0.0001）。低、中濃度辛伐他汀有上調(diào)DDAH1蛋白表達的趨勢，但未達到顯著地統(tǒng)計學(xué)意義;高濃度辛伐他汀處理24h可顯著上調(diào)DDAH1-V1蛋白表達(2.11±0.55 vs1±0.00，P=0.0097)。
　　(4)與DMSO組相應(yīng)時間點相比較，2.5μg/ml ActD在1～12h內(nèi)具有升高DDAH1-V1 mRNA△CT（

8、CTDDAH1轉(zhuǎn)錄本-CTGAPDH）的趨勢，且在處理后1h時達到統(tǒng)計學(xué)差異（5.63±0.64 vs4.64±0.37，P=0.011）。與ActD相應(yīng)時間點相比，1μM Sim+ActD處理組1～4hDDAH1-V1 mRNA△CT值出現(xiàn)降低的趨勢，但僅1h和2h出現(xiàn)顯著下降（1h:4.66±0.27 vs5.63±0.64,P=0.0085;2h:3.53±0.60 vs5.89±0.15，P=0.021）;2μM Sim+Act

9、D處理組1～8h DDAH1-V1 mRNA△CT值有下降的趨勢，僅1h時具有顯著的差異(4.36±0.17 vs5.63±0.64,P=0.0040)。
　　(5)與DMSO相比，ActD在8～12h有升高DDAH1-V2 mRNA△CT的趨勢，且在8h達到顯著地統(tǒng)計學(xué)差異（8.06±0.49 vs7.21±0.15，P=0.012）;與ActD2.5μg/ml相比，Sim1μM+ActD和Sim2μM+ActD處理對DDAH1

10、-V2 mRNA的△CT值無顯著影響。
　　(6)與DMSO相比，2.5μg/ml ActD處理2～12h DDAH1-V3 mRNA的△CT有升高的趨勢，但無顯著地統(tǒng)計學(xué)差異。與ActD2.5μg/ml處理組相比，Sim1μM+ActD處理和Sim2μM+ActD處理對DDAH1-V3mRNA的△CT無顯著影響。
　　結(jié)論:
　　(1)病理生理濃度的ADMA可促進原代培養(yǎng)的HUVECs細(xì)胞遷移，該作用可被辛伐他汀所逆