黃連素對福美雙誘導的肉雞脛骨軟骨發(fā)育不良的影響.pdf

1、肉雞脛骨軟骨發(fā)育不良(Tibial Dyschondroplasia，TD)，是伴隨著禽類的快速生長而出現(xiàn)的一種軟骨代謝疾病。其主要臨床特征初期為不愿意行走，采食量下降;進而表現(xiàn)為單腿或雙腿跛行，共濟失調;最后，隨著患病程度的不斷加深，嚴重者出現(xiàn)不能站立，甚至死亡的現(xiàn)象。病理學特征為:病雞脛骨近端干骺面，生長板內血管生成受到擾亂，不能滿足肥大區(qū)的軟骨細胞所需營養(yǎng)，使得鈣化區(qū)成骨受損，最后導致了白色軟骨栓的形成;此外，TD的發(fā)生與大量的軟

2、骨細胞損傷有著直接的關系。大量的軟骨細胞受損、相關蛋白分泌功能異常，最終導致了細胞外基質(ECM)不能及時、有序的降解，使得后期骨沉淀沒有足夠的空間而產生TD。隨著研究的深入人們認識到:細胞外基質金屬蛋白酶(MMPs)對TD的發(fā)生以及調控起著十分重要的作用。同時，細胞外基質金屬蛋白酶誘導因子(CD147)對MMPs的表達又有著有效的調控。在哺乳動物抗腫瘤的研究中，CD147可以通過調控MMPs的表達量，間接的調控細胞外基質ECM的含量，

3、從而影響血管的生成以及腫瘤的轉移。同時，在家禽TD的研究中，細胞外基質金屬蛋白酶MMPs也可以作為衡量TD發(fā)病程度的重要指標。黃連素是一種重要的生物堿，可以提取于常見的中藥黃連、黃柏、三顆針等當中。最近幾年中，隨著人們對黃連素研究的不斷深入，其廣泛的生物學功能逐漸被人們發(fā)現(xiàn)。除了傳統(tǒng)的抗菌、抗病毒作用外，黃連素對脂質代謝的調控、消炎反應的影響以及抗腫瘤的作用等成為研究熱點。在對小鼠關節(jié)炎作用中發(fā)現(xiàn)，黃連素可以在基因層面調控MMPs的表達

4、，從而產生積極的治療作用。這與TD的關聯(lián)十分緊密。本試驗旨在探究黃連素在福美雙誘導的TD中，對CD147及MMP-9表達的影響，以及黃連素在福美雙造成的TD肝臟損傷中的作用，進一步探明黃連素在TD中的作用機理。
　　本試驗采用1日齡AA肉雞，通過飼料中添加福美雙來誘導建立試驗模型。由于飼料中停止添加福美雙后，小雞TD可以緩慢的自我恢復，所以將試驗分為兩部分，分別探究TD在發(fā)病和自我恢復過程中，通過口腔給予黃連素治療后TD的恢復情況

5、。試驗通過觀察各組肉雞的生長狀況，生長板結構形態(tài)，熒光定量PCR檢測基因CD147及MMP-9的表達，CD147蛋白濃度的測定，以及肝臟SOD活性和血清中AST、AKP含量，來綜合說明黃連素在TD中的作用，為黃連素對TD的治療提供依據(jù)。試驗結果顯示:
　　探究黃連素在TD發(fā)病組中作用時，與對照組相比，從第3天開始通過飼料中連續(xù)添加福美雙，發(fā)病組中肉雞在第3天出現(xiàn)食欲下降，第6天出現(xiàn)了典型的TD癥狀——跛行，且隨著時間的推移，癥狀加

6、重，生長性能嚴重受到影響，而黃連素發(fā)病治療組中，小雞跛行癥狀在第10天得到控制，隨后TD癥狀逐漸緩解，生長性能得以改善;對生長板進行縱切后發(fā)現(xiàn)，發(fā)病組小雞生長板有著較大白色不透明軟骨栓，與自然發(fā)生的TD十分相似，而經(jīng)過黃連素治療后，軟骨栓變小;進行病理學觀察時發(fā)現(xiàn)，TD發(fā)病組中小雞生長板肥大區(qū)軟骨細胞大量死亡，且沒有血管浸潤，而治療后，死亡的肥大細胞比例降低，出現(xiàn)新生的血管浸潤在生長板肥大區(qū);對生長板細胞進行處理后分析，TD發(fā)病組中基因

7、CD147及MMP-9的表達量顯著下降，低于發(fā)病治療組（P＜0.01，P＜0.01）;在用免疫蛋白印跡分析后發(fā)現(xiàn)，生長板軟骨細胞中蛋白CD147表達量顯著下降，而對照組和TD發(fā)病治療組表達量基本一致;與對照組相比，TD發(fā)病組肝臟中SOD活性顯著下降（P＜0.01），血清中AST含量顯著升高（P＜0.01），AKP含量顯著下降（P＜0.01），TD發(fā)病治療組與對照組差異不顯著。
　　探究黃連素在TD恢復組中作用時，與對照組對比發(fā)現(xiàn)，

8、通過在第3到7天飼料中添加福美雙后，TD恢復組小雞和TD恢復治療組小雞都在第6天出現(xiàn)了典型的TD癥狀，停止福美雙添加后，TD恢復組小雞在第14天仍然有絕大部分不能站立行走，生長發(fā)育受到影響，而給予黃連素輔助恢復后，在第14天，大部分小雞行走能力和生長發(fā)育有了顯著提高;縱切生長板后發(fā)現(xiàn)，TD恢復組小雞生長板有白色不透明軟骨契存在，TD治療恢復組小雞生長板形態(tài)則基本與對照組相同;同時顯微鏡下觀察，黃連素治療恢復組小雞生長板新生的血管浸潤較T

9、D恢復組明顯增多而凋亡的細胞則較少;熒光定量PCR則顯示，TD治療恢復組小雞基因CD147及MMP-9的表達較TD恢復組明顯升高（P＜0.01，P＜0.01）;Western blot分析發(fā)現(xiàn)，蛋白CD147的表達在對照組、TD恢復組、黃連素治療恢復組沒有明顯差異;肝臟SOD活性，與對照組相比，TD恢復組顯著下降（P＜0.01），血清中AST含量顯著升高（P＜0.01），AKP含量顯著下降（P＜0.01），TD恢復治療組與對照組差異不顯