中草藥獨(dú)角蓮根莖提取物β-谷甾醇(β-sitosterol)對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景:
　　近期研究認(rèn)為，獨(dú)角蓮根莖水提取物(the aqueous extract from deiedpowdered rhizomes of Typhonium giganteum Engl.AEoTGE)對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的增殖具有抑制作用，其作用于細(xì)胞24h后，可顯著促進(jìn)細(xì)胞凋亡，凋亡率高達(dá)72％。然而，中草藥獨(dú)角蓮根莖成分復(fù)雜，其水提取物亦為混合物，并未能闡明其確切作用機(jī)制。獨(dú)角蓮莖塊中含有β-谷甾醇和β-谷甾醇-D

2、-葡萄糖苷。并且，研究表明β-谷甾醇(β-sitosterol)對乳腺癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞、口腔癌及食管癌等癌細(xì)胞的增殖活性均有抑制作用，通過內(nèi)源性和外源性途徑共同誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。因此，β-谷甾醇(β-sitosterol)可能影響瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞生物學(xué)特性。我們采用體外培養(yǎng)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞方法，并以β-谷甾醇(β-sitosterol)作為研究藥物，以不同濃度作用于細(xì)胞，了解藥物作用下細(xì)胞的增殖過程，并檢測β-谷甾醇(β-sitos

3、terol)是否促進(jìn)細(xì)胞凋亡，作為獨(dú)角蓮治療瘢痕的深入研究。
　　目的:
　　研究中草藥獨(dú)角蓮根莖提取物β-谷甾醇(β-sitosterol)對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖和凋亡的影響。
　　方法:
　　1、取患者耳部瘢痕疙瘩作為標(biāo)本，瘢痕疙瘩均由于皮膚穿刺受損后引起，發(fā)病3月余?；疾『蠡颊呶唇?jīng)過任何手術(shù)、藥物注射及物理治療。所取組織于4攝氏度環(huán)境中運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室，原代瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞均由體外組織塊培養(yǎng)法提取。2、選用

4、生長狀態(tài)良好第三代細(xì)胞，消化離心后，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。收集細(xì)胞數(shù)量一百萬個細(xì)胞，乙醇脫水后，在透射電鏡下觀察細(xì)胞胞核、細(xì)胞質(zhì)、高爾基體以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等超微結(jié)構(gòu)，并對細(xì)胞予以鑒定。3、選取對數(shù)生長期細(xì)胞，以含有濃度為20uM、30uM、40uM、50uMβ-谷甾醇的培養(yǎng)液孵育培養(yǎng)細(xì)胞24h，采用CellCounting Kit8細(xì)胞增殖檢測法測定24h內(nèi)β-谷甾醇對細(xì)胞活性的影響，于4h后用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度值。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行三次，得

5、出有效濃度梯度。4、選用生長狀態(tài)良好第三代細(xì)胞，消化離心后，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。對照組加入含有溶劑的全培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組分別加入不同濃度β-谷甾醇，終濃度為(30uM40uM50uM)，孵育箱孵育24h后，離心、重懸，加入500ul Binding Buffer液輕輕重懸細(xì)胞，隨后加入5ul FITC-AnnexinⅤ和10ul PI染色液，檢測相應(yīng)濃度下細(xì)胞凋亡率。
　　結(jié)果:
　　1、β-谷甾醇作用24h后，30uM40uM50

6、uM藥物濃度下，瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的生長明顯受到抑制。濃度為20uM時，細(xì)胞活性未受到明顯影響，當(dāng)藥物濃度大于30uM時，β-谷甾醇對細(xì)胞的抑制作用逐漸增強(qiáng)，與溶劑組和對照組相比，抑制作用明顯(p＜0.05);2、FITC-AnnexinⅤ/PI細(xì)胞流式染色顯示藥物組(30uM40uM50uM)凋亡率分別為8.5％，18.0％，33.2％，對照組為3％（p＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　β-谷甾醇作用于瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞24