全外顯子測(cè)序技術(shù)探尋卵巢子宮內(nèi)膜異位癥致病基因的研究.pdf

1、子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis, EMs)是一種復(fù)雜的婦科疾病,受遺傳、環(huán)境、免疫等相關(guān)因素影響,但至今病因未明,尋找致病基因是目前的研究熱點(diǎn)。全外顯子測(cè)序技術(shù)(Whole exome sequence, WES)是一種經(jīng)濟(jì)、有效的高通量測(cè)序技術(shù),對(duì)鑒定復(fù)雜疾病的致病基因有突破性發(fā)現(xiàn)。目前,國(guó)內(nèi)外尚無(wú)應(yīng)用WES研究 EMs的相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬采用 WES技術(shù)對(duì)在位、異位內(nèi)膜腺體細(xì)胞進(jìn)行分析,嘗試尋找相關(guān)基因改變,期望可以在基

2、因?qū)用嫔向?yàn)證病因假說,有助于明確EMs的發(fā)生機(jī)制。實(shí)驗(yàn)共分為兩個(gè)部分。
　　一、激光捕獲顯微切割技術(shù)應(yīng)用于子宮內(nèi)膜異位癥DNA提取及全基因組擴(kuò)增的方法學(xué)研究
　　目的:探索一套利用激光捕獲顯微切割技術(shù)( Laser capture microdissection, LCM)分離 EMs腺體細(xì)胞提取微量 DNA及全基因組擴(kuò)增( Whole genome amplification, WGA)的操作流程。方法:利用 LCM分別對(duì)

3、10例石蠟標(biāo)本及10例冰凍標(biāo)本進(jìn)行腺體細(xì)胞捕獲,收集足量腺體細(xì)胞后提取微量DNA,并對(duì)微量產(chǎn)物進(jìn)行濃度、吸光度檢測(cè),經(jīng)多聚酶鏈反應(yīng)(Polymerase chain reaction, PCR)擴(kuò)增進(jìn)行驗(yàn)證。另利用 LCM對(duì)5例石蠟標(biāo)本及5例冰凍標(biāo)本進(jìn)行捕獲,獲取細(xì)胞后行 WGA,檢測(cè)產(chǎn)物濃度、吸光度。選取8個(gè)常見的人體管家基因片段進(jìn)行PCR以驗(yàn)證產(chǎn)物完整性,并對(duì)兩組結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析。結(jié)果:冰凍與石蠟標(biāo)本在LCM獲取腺體細(xì)胞及提取微量

4、DNA的環(huán)節(jié)中均可獲得滿意效果。但經(jīng) WGA后,石蠟標(biāo)本無(wú)法保留完整的基因組信息。結(jié)論:采用LCM對(duì)EMs冰凍切片進(jìn)行腺體細(xì)胞捕獲并提取微量 DNA及 WGA是一種操作簡(jiǎn)便,結(jié)果穩(wěn)定、可靠的方法,可作為日后EMs基因組研究常規(guī)技術(shù)路線之一。
　　二、全外顯子測(cè)序技術(shù)探尋卵巢子宮內(nèi)膜異位癥致病基因的研究
　　目的:采用 WES技術(shù)對(duì) EMs在位、異位內(nèi)膜腺體細(xì)胞 DNA及外周血 DNA進(jìn)行分析,尋找相關(guān)致病基因。方法:將7例

5、LCM切割后在位、異位腺體細(xì)胞進(jìn)行 WGA,并提取該7例患者例外周血 DNA作為背景。合格標(biāo)本使用 Illumina Hiseq2000測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序,得出原始數(shù)據(jù),采用腫瘤分析流程進(jìn)行比對(duì)、過濾后對(duì) clean data進(jìn)行生物學(xué)信息分析。結(jié)果: MUC16、MGA、AHNAK、CENPE、HERC1、MAGEC1及PCLO7個(gè)基因可能參與卵巢內(nèi)異癥的發(fā)病,但確切結(jié)論需要后續(xù)大樣本量驗(yàn)證。結(jié)論:1.卵巢子宮內(nèi)膜異位癥在位內(nèi)膜組織及異