銀杏黃酮山萘酚和異鼠李素的體外代謝與藥物相互作用研究.pdf

1、銀杏(Ginkgobiloba)，是我國特有的珍稀樹種，俗稱“活化石”。銀杏葉味微苦，性平，其提取物的藥理作用有以下幾個方面：①改善心腦血管循環(huán)；②降低血清膽固醇；③抗菌消炎；④抗病毒；⑤清除自由基，抗氧化作用等。近幾年來，由于人們對銀杏葉藥用價值的認識水平不斷提高，相關(guān)制品已成為治療心腦血管動脈硬化、高血壓、糖尿病、腦中風、各種惡性腫瘤、老年性癡呆等多種疾病的首選天然藥物。 體內(nèi)外研究表明銀杏黃酮成分在小腸被吸收后，在小腸和肝

2、內(nèi)進行代謝，其主要代謝途徑為葡醛酸結(jié)合反應。但由于體內(nèi)環(huán)境的復雜性，銀杏黃酮體內(nèi)代謝產(chǎn)物不盡相同。 中藥可以誘導抑制肝藥酶，如銀杏葉成分槲皮素和山萘酚可以引起大鼠和人肝微粒體CYP1A1、1A2、3A4、2B蛋白活性降低。另外銀杏葉制劑作為一種心血管疾病的治療藥物，需要長期服用，在此期間有可能同時服用其他藥物，多種藥物合用，由于其中某一種成分對藥酶的誘導抑制作用，引起共服的其他藥物體內(nèi)處置發(fā)生變化，易產(chǎn)生藥物相互作用，導致不良反

3、應的發(fā)生。目前中草藥與西藥合用現(xiàn)象很普遍，由中藥引起的藥物相互作用已引起了國內(nèi)外學者的重視，國外學者已開展了相應的研究工作，相關(guān)文獻逐年增加，但國內(nèi)有關(guān)中藥相互作用的研究文獻甚少。 本實驗以銀杏黃酮山萘酚、異鼠李素和槲皮素為研究對象，以HPLC，LC/MS法為檢測手段，對以下三方面內(nèi)容進行研究：1)銀杏黃酮苷元山萘酚和異鼠李素在不同來源的肝微粒體中的體外代謝；2)山萘酚對一相代謝酶的抑制作用；3)三種黃酮苷元相互作用以及銀杏黃酮

4、與其他藥物的相互作用。以闡明銀杏黃酮山萘酚、異鼠李素的代謝途徑和對藥酶的抑制作用，探討銀杏黃酮與其他藥物(或各成分)之間的相互作用，為進一步研究銀杏成分的體內(nèi)過程奠定基礎(chǔ)。 一、山萘酚和異鼠李素的體外代謝 目的研究銀杏黃酮山萘酚和異鼠李素在不同種族(鼠、犬和人)、不同來源(誘導與未誘導)的肝微粒體中的一相和二相代謝作用，明確介導山萘酚和異鼠李素代謝的主要藥酶，獲得兩者代謝的主要途徑。方法1)山萘酚和異鼠李素在鼠肝微粒體中

5、的一相代謝。取山萘酚(或異鼠李素)，分別與苯巴比妥(PB)、地塞米松(DEX)或β-萘黃酮(BNF)誘導的鼠肝微粒體(1mg蛋白質(zhì)·mL-1)于37℃下共孵育，孵育一定時間后加6﹪HClO4終止反應，10000r·min-1離心，取上清液，HPLC法測定山萘酚(或異鼠李素)的剩余濃度。以未誘導處理的鼠肝微粒體為對照，比較不同誘導劑處理的鼠肝微粒體對山萘酚(或異鼠李素)一相代謝的催化活性。2)山萘酚和異鼠李素在鼠肝微粒體中的二相代謝。采用

6、苯巴比妥(PB)、地塞米松(DEX)、β-萘黃酮(BNF)和地非三唑(DIPH)誘導SD大鼠，與未誘導大鼠分別作為體外代謝的5種不同酶源。取一定量山萘酚(或異鼠李素)與鼠肝微粒體(0.2mg蛋白質(zhì)·mL-1)在25℃下共孵育，用6﹪HClO4終止反應，乙醚-丙酮溶液提取，HPLC法測定剩余底物或產(chǎn)物濃度，LC-MS法分析代謝物結(jié)構(gòu)。以未作任何處理的鼠肝微粒體為對照，比較不同誘導劑處理的鼠肝微粒體對山萘酚(或異鼠李素)代謝的催化活性。3)

7、山萘酚和異鼠李素在人肝或犬肝微粒體中的二相代謝。按鼠肝微粒體中的方法操作，但人肝微粒體蛋白濃度為1mg·mL-1，孵育溫度為37℃。犬肝微粒體蛋白濃度和孵育溫度同鼠肝微粒體。結(jié)果1)山萘酚在BNF誘導的鼠肝微粒體中的一相代謝反應相對較強，孵育60min后，有18.26﹪量被代謝，其中一個代謝產(chǎn)物為槲皮素，而在對照組和其他誘導劑處理的微粒體中代謝甚微(代謝率為3～7﹪)。異鼠李素在不同鼠肝微粒體中代謝均不明顯(代謝率為2～8﹪)。2)山萘

8、酚和異鼠李素在BNF和DIPH誘導的鼠肝微粒體中有較強的二相代謝作用，而在PB、DEX誘導的鼠肝微粒體和對照組微粒體中的代謝較弱。40μg·mL-1的山萘酚在微粒體中孵育45min后，分別有62.9﹪(DIPH)，40.1﹪(BNF)，21.1﹪(PB)，23.7﹪(DEX)和18.0﹪(對照組)的量被代謝。測得山萘酚在對照組、BNF和DIPH誘導的微粒體中的Km值分別為(1.85±1.05)，(9.41±2.45)和(72.4±3.0

9、8)μmol·L-1；vmax值為(2.45±0.63)，(7.55±1.40)和(25.2±1.08)μmol·g-1·min-1。40μg·mL-1的異鼠李素經(jīng)60min孵育后，分別有70.9﹪(DIPH)，43.7﹪(BNF)，26.3﹪(PB)，26.8﹪(DEX)和19.2﹪(對照組)的量被代謝。測得異鼠李素在對照組、BNF和DIPH誘導的微粒體中的Km值分別為(1.95±0.54)，(7.13±0.73)和(61.4±6.5

10、0)μmol·L-1；vmax值為(1.15±0.17)，(3.05±0.26)和(22.7±2.13)μmol·g-1·min-1。檢測到山萘酚的二個葡醛酸結(jié)合產(chǎn)物和一個未知代謝產(chǎn)物；異鼠李素有四個代謝產(chǎn)物被檢出，經(jīng)HPLC-MS分析，均為一分子的葡醛酸結(jié)合物。3)山萘酚和異鼠李素在人肝微粒體中的二相代謝較弱。孵育60min后，僅16.04﹪的山萘酚或13.36﹪的異鼠李素被代謝。山萘酚和異鼠李素在犬肝微粒體中分別代謝19.55﹪和2

11、1.12﹪，代謝程度與空白鼠肝微粒體較接近。結(jié)論1)山萘酚和異鼠李素的一相代謝作用相對較弱，僅在BNF誘導的鼠肝微粒體中觀測到山萘酚的3'-位羥化反應(轉(zhuǎn)變成槲皮素)。2)山萘酚和異鼠李素在不同誘導劑處理的鼠肝微粒體中有不同程度的葡醛酸結(jié)合代謝反應，其中BNF和DIPH誘導的鼠肝微粒體對山萘酚和異鼠李素的葡萄糖醛酸苷結(jié)合反應起主導作用。3)相對于鼠肝微粒體，在人肝微粒體中山萘酚和異鼠李素的葡醛酸結(jié)合反應最弱，犬肝微粒體次之。 二

12、、山萘酚對細胞色素P450的抑制作用 目的：研究山萘酚對鼠肝微粒體中CYP的抑制作用。方法：選擇細胞色素P4501A，2B，3A的專屬底物乙氧基異吩惡唑(ER)，戊氧基異吩惡唑(PR)和地西泮、睪酮、硝苯地平與山萘酚分別在BNF，PB，DEX誘導的鼠肝微粒體中于37℃下共孵育一定時間。加冰甲醇中止反應，10000r·min-1離心，取上清液，熒光法測定ER或PR的代謝產(chǎn)物異吩惡唑的濃度，HPLC法測定底物地西泮、睪酮或硝苯地平的

13、剩余濃度，用Dixon圖來計算抑制常數(shù)Ki值。山萘酚對以上底物的抑制常數(shù)Ki值分別與CYP1A，2B，3A的典型抑制劑氟伏沙明、司可巴比妥鈉和酮康唑的抑制常數(shù)Ki值進行比較。結(jié)果：(1)山萘酚對ER脫乙氧基形成異吩惡唑的代謝反應有強的抑制作用，抑制常數(shù)Ki為5.86±0.84μmol·L-1，其對ER代謝的抑制能力約為氟伏沙明(Ki為11.03±0.27μmol·L-1)的2倍。山萘酚對戊氧基異吩惡唑代謝的抑制常數(shù)Ki為7.78±1.3

14、6μmol·L-1，與司可巴比妥鈉的抑制常數(shù)(Ki為6.65±2.41μmol·L-1)較為接近。山萘酚對地西泮，睪酮，硝苯地平的代謝有弱的抑制作用，與CYP3A酶的特異性抑制劑酮康唑相比，抑制能力要弱得多，測得山萘酚對地西泮，睪酮，硝苯地平的抑制常數(shù)在86～183μmol·L-1范圍，而酮康唑的抑制常數(shù)在1.83～2.83μmol·L-1范圍。結(jié)論：山萘酚能顯著抑制CYP1A酶和CYP2B酶的活性，而對CYP3A酶的抑制作用較弱。

15、 三、銀杏黃酮山萘酚與其它黃酮成分或藥物的代謝性相互作用。 目的：研究山萘酚與槲皮素、異鼠李素以及可能與之合用的藥物在鼠肝微粒體中的代謝相互作用。方法：1)取銀杏黃酮苷元山萘酚、異鼠李素、槲皮素，采用兩兩共孵育的方法，分別以一個成分為底物，另一成分為抑制劑，在BNF誘導的鼠肝微粒體中于25℃下共孵育一定時間。6﹪HClO4終止反應，10000r·min-1離心，取上清液，HPLC法測定底物的剩余濃度，計算各黃酮成分對其他黃酮

16、成分的抑制常數(shù)Ki值。2)選用幾種UGT的底物(撲熱息痛、異丙酚、對硝基苯酚、鹽酸多巴酚丁胺)與山萘酚在BNF誘導的鼠肝微粒體中共孵育，采用HPLC法分別測定孵育液中底物山萘酚的剩余濃度，計算這些共孵育底物對山萘酚的抑制常數(shù)(Ki值)。3)觀察山萘酚對鹽酸普萘洛爾在BNF誘導的鼠肝微粒體中的一相代謝的抑制程度。結(jié)果：1)銀杏黃酮三種成分之間相互有較強的抑制作用，抑制常數(shù)分別為：山萘酚對槲皮素和異鼠李素的Ki值為4.64±3.45μmol

17、·L-1和18.42±3.87μmol·L-1；槲皮素對山萘酚和異鼠李素的Ki值為11.10±0.30μmol·L-1和2.26±0.99μmol·L-1；異鼠李素對山萘酚和槲皮素的Ki值為24.99±2.87μmol·L-1和5.27±2.40μmol·L-1。2)UGT底物撲熱息痛、異丙酚、鹽酸多巴酚丁胺對山萘酚二相代謝基本無抑制作用，對硝基苯酚對山萘酚有微弱的抑制，抑制常數(shù)Ki為204.0±8.66μmol·L-1。3)山萘酚對鹽