黃芩素與UDP-glucuronosyltransferase(UGT)的體外相互作用.pdf

1、黃芩素是傳統(tǒng)中藥黃芩的主要有效成分之一，屬于黃酮類化合物，現(xiàn)市售的雙黃連口服液、黃連素和牛黃解毒片（丸）等中成藥中均含有此成分。黃芩素的藥理學(xué)活性廣泛，其抗菌譜廣，作用強(qiáng)大，對(duì)多種病毒也有較強(qiáng)的抑制作用，還有良好的抑制炎癥效應(yīng)。此外，由于結(jié)構(gòu)上酚羥基的存在，黃芩素還具有很強(qiáng)的抗氧化和清除氧化自由基的作用。近年來，許多研究表明，黃芩素對(duì)多種腫瘤細(xì)胞有較好的抑制作用。
　　黃酮類化合物的吸收都具有一個(gè)共性——首過效應(yīng)，這是導(dǎo)致此類化合

2、物在體內(nèi)生物利用度低的主要原因?？诜S酮類化合物，首先跨膜進(jìn)入小腸粘膜，被小腸粘膜中的UGT代謝生成葡萄糖醛酸結(jié)合物，隨著結(jié)合物的排泄導(dǎo)致了該類化合物生物利用度下降。隨著對(duì)代謝酶UGT的進(jìn)一步研究，發(fā)現(xiàn)越來越多的中藥都是通過這一途徑代謝排出體外的，還有很多藥物可能會(huì)對(duì)UGT產(chǎn)生抑制或者誘導(dǎo)作用，一旦聯(lián)合用藥，血藥濃度就會(huì)發(fā)生變化，血藥濃度下降藥效降低，反之，可能會(huì)發(fā)生中毒等不良事件。與西藥相比，中藥可以直接發(fā)生Ⅱ相代謝反應(yīng)，西藥一般先經(jīng)

3、過Ⅰ相代謝的功能化修飾，而葡萄糖醛酸化反應(yīng)則是單羥基或多羥基黃酮的主要代謝途徑。深入研究中藥對(duì)代謝酶UGT的影響，不僅可以促進(jìn)合理用藥，還能提高中藥的有效性和安全性。近年來，黃酮類化合物憑借其優(yōu)良的藥理學(xué)活性，其代謝過程受到了廣泛的關(guān)注。因此，借鑒西方新藥研發(fā)的成功經(jīng)驗(yàn)，將ADME/T評(píng)價(jià)，尤其是將早期代謝性質(zhì)引入中藥的科學(xué)性評(píng)價(jià)，這可以加速中藥現(xiàn)代化、科學(xué)化的進(jìn)程。
　　本課題利用人肝、動(dòng)物肝微粒體和人重組單酶等孵育體系，對(duì)黃芩

4、素的種屬差異性，性別影響，代謝穩(wěn)定性和藥物-藥物相互作用進(jìn)行了系統(tǒng)研究。
　　1、建立黃芩素及其代謝產(chǎn)物的高效液相色譜分析方法
　　首先建立了黃芩素及其代謝產(chǎn)物在肝微粒體孵育體系中的高效液相色譜分析方法。所建立的方法具有良好的特異性，其精密度、穩(wěn)定性和準(zhǔn)確度等定量研究均符合方法學(xué)的要求，經(jīng)過方法學(xué)的驗(yàn)證，該方法可以滿足黃芩素及其葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物在后續(xù)研究中的定量要求。在此基礎(chǔ)上，論文著重對(duì)黃芩素進(jìn)行了體外Ⅱ相代謝研究，闡

5、明化合物的代謝途徑，種屬和性別差異。
　　2、黃芩素葡萄糖醛酸化代謝的種屬差異研究
　　本文系統(tǒng)研究了黃芩素的體外葡萄糖醛酸化代謝的種屬差異，發(fā)現(xiàn)黃芩素在人、SD大鼠、猴、比格犬和豬肝微粒體中的代謝譜相同，均會(huì)代謝生成黃芩素-6-O-β-葡萄糖醛酸（B-6G）和黃芩素-7-O-β-葡萄糖醛酸(B-7G)的單一葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物。但是動(dòng)力學(xué)方面存在顯著的差異性:隨著底物濃度的增加，反應(yīng)速率加快，豬肝微粒體的代謝速率最快，之后

6、是人、猴、SD大鼠和狗;從清除率上來看，豬肝微粒體仍居首位，其次是SD大鼠、人、猴和比格犬。黃芩素在猴和人中清除率是相近的，主要是由于B-7G的Km在猴肝微粒體中小于人肝微粒體，而Vmax則相反，導(dǎo)致了相似的清除率。因此，恒河猴是黃芩素葡萄糖醛酸化代謝研究的合適模型。
　　3、黃芩素葡萄糖醛酸化代謝的性別差異研究
　　本論文在種屬差異的研究基礎(chǔ)上對(duì)性別的差異性進(jìn)行了系統(tǒng)的論證，研究表明黃芩素的葡萄糖醛酸化代謝譜在性別方面雖然

7、不存在差異性，但是在大鼠中其動(dòng)力學(xué)表現(xiàn)出明顯的性別差異，雌性的代謝速率慢于雄性，清除率相差10倍之多，產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因很可能是雌雄個(gè)體間激素差異對(duì)酶表達(dá)的影響。但是黃芩素代謝在雌雄比格犬和恒河猴肝微粒體的性別差異性并沒有在SD大鼠中表現(xiàn)的明顯，這可能與狗和猴中缺少UGT1A1酶有關(guān)。
　　4、黃芩素葡萄糖醛酸化體外代謝的穩(wěn)定性
　　由于在性別差異性的研究中我們發(fā)現(xiàn)黃芩素的代謝很可能與UGT1A1有著密切的關(guān)系，因此對(duì)黃芩素

8、的Ⅱ相代謝進(jìn)行進(jìn)一步的研究。黃芩素的兩個(gè)代謝產(chǎn)物不完全是由相同的代謝酶代謝，B-7G主要是由UGT1A1，UGT1A8，UGT1A9和UGT2B15共同介導(dǎo)，而B-6G主要是經(jīng)UGT1A1，UGT1A8和UGT1A9共同介導(dǎo)的。此外，用選擇性抑制劑尼洛替尼（UGT1A1抑制劑）、厚樸酚(UGT1A9抑制劑)和甲滅酸（UGT2B7抑制劑）在人、SD大鼠、狗、猴和豬肝微粒體中驗(yàn)證，證實(shí)UGT1A1是最主要的代謝酶，UGT1A1對(duì)黃芩素葡萄糖

9、醛酸化的貢獻(xiàn)率最大。此外，黃芩素在UGT1A1，UGT1A8，UGT1A9和UGT2B15的代謝動(dòng)力學(xué)都屬于經(jīng)典的米氏動(dòng)力學(xué)，并經(jīng)過Eadie-Hofstee作圖驗(yàn)證。
　　5、黃芩素的藥物-藥物相互作用評(píng)價(jià)
　　藥物相互作用是藥物安全性和藥效評(píng)價(jià)的一部分。候選物的CYP酶誘導(dǎo)和UGT酶抑制能力評(píng)價(jià)已成為新藥研發(fā)中一個(gè)必不可少的環(huán)節(jié)。體外應(yīng)用新鮮或凍存的原代人肝細(xì)胞的酶誘導(dǎo)方法及UGT重組酶法評(píng)價(jià)黃芩素與代謝酶之間的相互作用

10、。經(jīng)過與陽性藥物對(duì)照，黃芩素對(duì)CYP1A2，CYP3A4和CYP2B6的誘導(dǎo)效果沒有達(dá)到FDA要求，對(duì)代謝酶UGTs也不具有明顯的抑制作用。
　　本研究有助于在藥物早期的研究過程中，對(duì)中藥中的單體成分的“成藥性”進(jìn)行評(píng)估。通過對(duì)黃芩素上述性質(zhì)的研究，在此要注意黃芩素與其他藥物聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，要避免與UGT1A1的抑制劑合用，避免藥物在體內(nèi)的蓄積，從而引起中毒等不良事件。通過深入研究藥物對(duì)CYP酶的誘導(dǎo)和UGT抑制的相互作用機(jī)制能對(duì)該類