樹突狀細(xì)胞與馬爾尼菲青霉酵母體外相互作用的研究.pdf

1、一.本研究DCs與真菌的相互作用關(guān)系，有利于闡明真菌的致病機制以及為抗真菌治療奠定理論基礎(chǔ)。然而，目前關(guān)于DCs與真菌相互作用的研究國內(nèi)外均較少，在國內(nèi)僅有一份關(guān)于DCs與曲霉的研究報道，DCs與P．marneffei相互作用的研究仍是空白，有待于我們加強這方面的研究，以了解宿主的抗P．marneffei感染的免疫機制和P．marneffei逃避機體免疫的機理。同時也為發(fā)展有效的免疫治療和開發(fā)新型的抗P．marneffei疫苗提供重要基

2、礎(chǔ)。 二、本研究目的以人髓系DCs為靶細(xì)胞，研究P．marneffei酵母對人DCs膜表面MHC-Ⅱ類分子、表面協(xié)同刺激分子、趨化因子受體的表達(dá)情況的影響以及觀察經(jīng)P．marneffei酵母沖擊的DCs產(chǎn)生細(xì)胞因子IL-12和刺激T淋巴細(xì)胞增殖的情況，探討DCs在P.marneffei感染中的作用機制，為闡明P．marneffei感染的發(fā)病機制并指導(dǎo)臨床治療提供科學(xué)依據(jù)。 三、實驗對象和方法1.酵母細(xì)胞的制備PMSUMS

3、0152(經(jīng)形態(tài)學(xué)及DNA測序鑒定證實)，由本真菌室從1名2歲的血液病患兒血液中分離。 2.人外周血單核細(xì)胞來源的DCs的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)無菌采取健康人外周靜脈血，肝素抗凝。 3.DCs的表型分析收集各組的DCs，用PBS液洗滌細(xì)胞兩次，分別加入異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)或藻紅蛋白熒光(phycoerythrin，PE)標(biāo)記的單克隆抗體CDIa、CD86、CD83、CD4

4、0、HLA-DR。避光4℃標(biāo)記30分鐘，PBS液洗滌2次后用流式細(xì)胞儀檢測。 4.IL-12p70的檢測收集各實驗組細(xì)胞培養(yǎng)上清液-80℃保存。用酶聯(lián)免疫吸附劑測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)法檢測各組DCs培養(yǎng)上清液中自介素(interleukin，IL)-1 2p70的含量，操作嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。試劑盒最低檢測量為7.5pg／mL。 5.混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(m

5、ixed lymphocyte reacion，MLR)另取健康人外周血，按前述方法分離外周血單個核細(xì)胞，收集非貼壁細(xì)胞為淋巴細(xì)胞。用尼龍毛法分離同種異體效應(yīng)T淋巴細(xì)胞。 一 6.Real-time PCR法對趨化因子受體CCR7、CXCR4的mRNA水平的檢測采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，RNA電泳和紫外分光光度計評估其完整性并估算其產(chǎn)量。以lμg的總RNA為模板合成cDNA。 7.統(tǒng)計學(xué)處理正態(tài)分布計量資料以平

6、均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，三組間均數(shù)比較采用方差分析，非正態(tài)分布計量資料及方差不齊時采用非參數(shù)Kruskal-Wallis檢驗。采用SSPS 11.5統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，顯著性水準(zhǔn)設(shè)為0.05。實驗重復(fù)3～6次，每次實驗細(xì)胞來自不同的供者。 四、實驗結(jié)果1.人外周血單核細(xì)胞來源DCs的形態(tài)及其對P.marneffei酵母的吞噬從外周血獲得的單核細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)7天，細(xì)胞由貼壁狀態(tài)逐漸轉(zhuǎn)為懸浮，細(xì)胞體積顯著增大，形態(tài)不規(guī)則，毛刺多而密。

7、流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞膜表面高表達(dá)人外周血非成熟DCs的相對特異性標(biāo)志CDla。DCs和P．marneffei酵母共培養(yǎng)2h即可以看見顯著的吞噬現(xiàn)象，6h后可見DCs內(nèi)含有大量P.marneffei酵母。 2.DCs受P．marneffei酵母沖擊后膜表面分子的變化對DCs的表型檢測發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)7天后，DCs表面成熟標(biāo)志CD83，協(xié)同刺激分子CD86、CD40和MHC-Ⅱ類分子HLA-DR和比例較低；而DCs與Pmarneffei 酵

8、母共培養(yǎng)24 h后，表型發(fā)生了改變，上述表面分子的表達(dá)明顯增高，顯示了DCs的進(jìn)一步成熟。 3.DCs受P.marneffei酵母沖擊后分泌IL-12p70的變化未受P．marneffei酵母沖擊的DCs培養(yǎng)上清液中未檢測到IL-12p70的產(chǎn)生，而接受P.marneffei酵母沖擊的DCs培養(yǎng)上清液中可以檢測到IL-12p70的產(chǎn)牛量為28.64±8.4lpg／mL，但較LPS刺激組115.90±19.89pg／mL低，三組間

9、在統(tǒng)計學(xué)上有顯著性差異(P<0.05)。 4.DCs受P.marneffei酵母沖擊后刺激同種異體淋巴細(xì)胞增殖的能力成熟的DCs高表達(dá)共刺激分子，有較強的刺激T淋巴細(xì)胞活化增殖的能力。 5.DCs受P.marneffei酵母沖擊后趨化因子的表達(dá)情況經(jīng)P．marneffei酵母沖擊后的。DCs趨化因子受體CCR7的mRNA的表達(dá)量較未受沖擊的DCs顯著增高，其增高程度較LPS刺激組高，三組間在統(tǒng)計學(xué)上有顯著性差異(P<0.

10、01)。 五、結(jié)論1.利用GM-CSF和IL-4可以成功誘導(dǎo)出足量的具有典型細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞表型的非成熟DCs。 2.體外培養(yǎng)的人外周血單核細(xì)胞來源的DCs能有效地吞噬加熱滅活的P．marneffei酵母細(xì)胞。 3.DCs接受P．marneffei酵母沖擊后，膜表面MHC—Ⅱ分子和協(xié)同刺激分子CD86、CD40、CD83的表達(dá)顯著上調(diào)，能夠有效刺激T淋巴細(xì)胞的增殖分化。 4.經(jīng)P．marneffei酵母沖擊