腫瘤缺氧微環(huán)境、腫瘤細(xì)胞與樹(shù)突狀細(xì)胞間相互作用的初步探討.pdf

1、研究目的:
　　卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)中最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其死亡率在各類婦科腫瘤中位居首位，嚴(yán)重威脅了婦科腫瘤患者的生命。雖然多年來(lái)卵巢癌的診斷和治療手段已得到顯著提高，但是卵巢癌的患者5年生存率仍僅為30％。卵巢癌患者的死因多是由于遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，然而對(duì)于卵巢癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的病理機(jī)制我們尚未完全清楚。因此，研究卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制并探索一個(gè)有效的監(jiān)測(cè)指標(biāo)對(duì)于卵巢癌的診治是十分必要的。
　　缺氧是實(shí)體腫瘤微環(huán)境的基本特征之一，在促進(jìn)

2、腫瘤進(jìn)展、癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用。大量體外實(shí)驗(yàn)證明了缺氧能夠產(chǎn)生和誘導(dǎo)某些蛋白酶，從而降解細(xì)胞外基質(zhì);臨床研究也表明腫瘤缺氧與腫瘤轉(zhuǎn)移傾向有一定的關(guān)系。缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α（Hypoxia-inducible factor-1α）是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧代謝的核心因子，在缺氧環(huán)境中表達(dá)上調(diào)，參與了腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的調(diào)控。HIF-1α與多種腫瘤關(guān)系已經(jīng)得到證實(shí)，但對(duì)卵巢癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響尚未得到闡明。本研究將選擇卵巢癌A27

3、80細(xì)胞來(lái)檢測(cè)缺氧環(huán)境下HIF-1α對(duì)卵巢癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響及其機(jī)制。
　　研究方法:
　　1.采用乏氧培養(yǎng)箱模擬腫瘤低氧微環(huán)境，分別在常氧和缺氧的環(huán)境中培養(yǎng)卵巢癌A2780細(xì)胞;
　　2.通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和蛋白質(zhì)印跡(western blot)檢測(cè)缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)和基質(zhì)金屬蛋白酶13(MMP13) mRNA及蛋白的在常氧和缺氧環(huán)境中的表達(dá)情況;
　　3.應(yīng)用小干

4、擾RNA(small interfering RNA，siRNA)轉(zhuǎn)染卵巢癌A2780細(xì)胞，通過(guò)顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率，并通過(guò)RT-PCR驗(yàn)證siRNA對(duì)A2780細(xì)胞HIF-1α基因抑制結(jié)果;
　　4.通過(guò)RT-PCR和western blot檢測(cè)siRNA干擾HIF-1α基因后MMP13 mRNA及蛋白的表達(dá)變化;
　　5.通過(guò)對(duì)穿過(guò)Transwell小室人工基底膜的細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)，比較常氧環(huán)境下與缺氧環(huán)境下卵巢癌細(xì)胞

5、的侵襲轉(zhuǎn)移能力，以及siRNA干擾HIF-1α基因前后卵巢癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1.卵巢癌A2780細(xì)胞中HIF-1α mRNA在正常氧環(huán)境中可見(jiàn)表達(dá)，HIF-1α的mRNA水平隨缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)水平逐漸升高;正常氧環(huán)境中HIF-1α蛋白表達(dá)較少，經(jīng)缺氧培養(yǎng)后，A2780細(xì)胞中HIF-1α的蛋白含量明顯增多，在缺氧處理24h后其蛋白表達(dá)水平最高;
　　2.應(yīng)用FAM-siRNA轉(zhuǎn)染A2780細(xì)

6、胞，在顯微鏡下可觀察到分布廣泛的熒光，轉(zhuǎn)染效率可達(dá)85％以上，說(shuō)明siRNA成功轉(zhuǎn)入A2780細(xì)胞并取得良好的轉(zhuǎn)染效果;
　　3.siRNA能夠有效地抑制HIF-1α基因的表達(dá)，mRNA水平抑制率達(dá)到80％，蛋白水平抑制率達(dá)到60％以上;
　　4.與常氧培養(yǎng)環(huán)境相比，缺氧環(huán)境培養(yǎng)卵巢癌細(xì)胞中MMP13在mRNA水平和蛋白水平均顯著增多，經(jīng)相關(guān)性分析，MMP13表達(dá)與HIF-1α呈正相關(guān)，Pearson相關(guān)系數(shù)為0.8813;