CYP450 3A及其等位基因在體外藥物代謝和藥物相互作用中的對比研究.pdf

1、目的：人細胞色素P450(CYP450)在肝臟中是含有亞鐵血紅素蛋白的超基因家族。參與大部分藥物的代謝過程，也被稱為混合功能氧化酶或單加氧酶。CYP3A被認為是人類P450家族在某些器官中最主要的功能形式。約占肝臟中總P450含量的30％，參與45％-60％常用藥物在體內(nèi)的代謝轉(zhuǎn)化過程，包括氧化、過氧化或者還原等。CYP3A4和CYP3A5是肝臟和腸道中主要的CYP3A功能形式，代謝大部分相同的底物，但具有不同的代謝常數(shù)。而且由于這兩者

2、在個體中含量的不同，因此可能具有不同的藥物代謝能力。CYP3A4亞家族中由于基因、年齡、疾病狀態(tài)等因素，酶活性之間具有明顯的個體差異，不僅表現(xiàn)在肝臟表達水平差異約40倍，且個體對藥物的體內(nèi)代謝能力也相差10倍左右。其中，基因因素的作用約占60％～90％。目前，發(fā)現(xiàn)許多CYP3A4等位基因可能是造成個體間藥物代謝差異的一個重要因素。實驗?zāi)康氖牵和ㄟ^體外的對比研究，找出CYP4503A的CYP3A5*1A(WT)(野生型)和CYP3A4*1

3、A(WT)和CYP3A4*3(M445T)，*4(1118V)，*17(F189S)，*18(L293P)等位基因在藥物代謝和藥物抑制中的差異，分析其差異性存在的原因。 方法：在已有的CYP3A4和CYP3A5的野生型模板情況下，利用不對稱PCR的方法在CYP3A4野生型基因中引入各等位基因的突變位點，利用酶KpnⅠ和XhoⅠ消化產(chǎn)生插入片段，與含有同樣酶切位點的大腸桿菌pYES2/CT載體進行連接，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中。通過氨

4、芐青霉素抗性標記篩選出重組子，初步鑒定后，再通過測序確認，無非同義突變后，轉(zhuǎn)化入整合有POR基因的酵母菌株中，利用半乳糖誘導(dǎo)重組子在酵母系統(tǒng)中進行表達，差速離心法制備得到微粒體。并用CYP3A的特異性反應(yīng)：熒光底物DBF(Dibenzylfluorescein)的去甲基化和硝苯地平的氧化，進行酶動力學(xué)的分析，非線性回歸分析法計算出Km值和Vmax值，進而得到體外代謝的內(nèi)在清除率CLint，以此為依據(jù)比較各重組酶的代謝差異。與此同時，使用

5、原生型和各突變株微粒體蛋白在兩種檢測系統(tǒng)中分別對19種和6種藥物進行篩選，求出其IC50值，研究藥物抑制的相互作用。 結(jié)果：釀酒酵母表達體系是CYP450酶系理想的體外表達體系。體外酶動力學(xué)和藥，物抑制的對比研究中發(fā)現(xiàn)：除CYP3A4*17等位基因酶外，3A5-WT，3A4—WT，和CYP3A4*3，*4，*18均能將DBF和硝苯地平代謝成相應(yīng)的產(chǎn)物，*17號由于活性幾乎喪失因此也無法進行后續(xù)的藥物抑制實驗。 在CYP3

6、A4和CYP3A5的對比研究中發(fā)現(xiàn)：3A5-WT對DBF和硝苯地平的親和力較3A4—WT的低(Km分別是后者的2.0和3.0倍）。3A5-WT對兩種底物的CLint分別比3A4—WT降低了2倍和3倍(p＜0.05，n≥3）。在兩種底物的抑制實驗中，兩株野生型均能被酮康唑強烈的抑制，但是對CYP3A5-WT的抑制沒有3A4—WT的強，對前者的IC50值分別是0.012和0.036μM，對后者的IC50值分別是0.040和0.049μM。另

7、外18種藥物除了那些對兩者都不存在抑制的藥物外，平均而言大部分藥物對3A5-WT的IC50是對3A4—WT的4倍。 在3A4—WT與其等位基因的對比研究中：各等位基因?qū)BF的親和力與WT相當(dāng)(Km相近)，*3和*18的CLint分別是WT的3.1和3.8倍(p＜0.05)，*4僅是WT的1.3倍(p=0.1010)。各等位基因?qū)ο醣降仄降挠H和力均比WT低(Km依次分別是WT的1.6、2.0和1.3倍)，*4和*18的CLmt分

8、別是WT的0.7和2.6倍(p＜0.05)，*3與WT相當(dāng)(p=0.7676)。以DBF為底物時，藥物對WT和各等位基因的抑制程度排序為：酮康唑＞地爾硫卓＞曲格列酮＞舍曲林＞維拉帕米＞氟西?。敬蠓隹担緤W美拉唑＞紅霉素＞來適可＞文迪亞＞泰洛平＞普拉固=立普陀=華法林=萬絡(luò)=辛伐他汀=西咪替汀。藥物對WT和各等位基因酶的抑制程度的排序為：*3＞*18＞W(wǎng)T＞*4。以硝苯地平為底物時，藥物對WT和各等位基因的抑制程度排序為：酮康唑＞地爾硫卓＞

9、維拉帕米＞大扶康＞西樂葆＞萬絡(luò)，六種藥對WT和各等位基因酶的抑制程度的排序為：WT＞*18＞*3＞*4。針對某種藥物的具體抑制情況，3A4多態(tài)性現(xiàn)象依然存在，且存在明顯的底物依賴現(xiàn)象。氨基酸順序不同或者改變后，酶動力學(xué)特征發(fā)生明顯改變，且對藥物抑制的程度也發(fā)生了一定變化。 結(jié)論：等位基因和WT相比，氨基酸改變后，酶動力學(xué)特征與野生型有明顯差異，且對藥物抑制的程度也發(fā)生了改變。此外，本實驗成功構(gòu)建了在酵母表達系統(tǒng)中高效表達CYP3