重組人CYP2D6重要等位基因的體外表達及其在藥物代謝和藥物-藥物相互作用中的對比研究.pdf

1、細胞色素P450是人體內(nèi)外源化合物清除的最重要的酶，負責藥物的代謝，致癌物及有毒化合的清除等，賦予肝臟解毒的功能。CYP2D6是細胞色素P450超家族中最具有多態(tài)性的CYP酶。CYP2D6多態(tài)性的遺傳分子基礎(chǔ)已經(jīng)得到闡明，CYP2D6基因的多態(tài)性——基因的缺失，重復，單核甘酸多態(tài)性(SNP)等是其多態(tài)性主要的分子基礎(chǔ)?；虻亩鄳B(tài)性導致CYP2D6表型的多樣性，不同個體代謝CYP2D6的底物的能力表現(xiàn)出明顯的差異，從弱代謝者(PMs)到超

2、快代謝者(UMs)，普遍存在于高加索人群和東方人群中。不同個體對藥物代謝能力的差異導致個體在服用相同劑量的藥物的治療效果存在不均勻性(HTE)。CYP450介導的藥物—藥物相互作用(DDI)是目前臨床用藥安全中一個重要因素，為了避免聯(lián)合用藥中的DDI，各個研究機構(gòu)做了大量的體外和臨床的研究工作。CYP2D6的遺傳多態(tài)性及其在藥物代謝中所占的比重，使其在藥物—藥物相互作用研究中成為重要的研究對象。 目前已經(jīng)得到明確鑒定的CYP2D

3、6等位基因突變體超過50種，其中CYP2D6*2，CYP2D6*10和CYP2D6*17是最為重要的三個等位基因突變體。CYP2D6*2導致兩個氨基酸替換(R296C和S486T)，在高加索人群中的分布頻率高達27.1～32.4％。CYP2D6*10含有兩個錯義突變導致兩個氨基酸替換(P34S，S486T)，在東方人群中的分布頻率達40.8～49.5％。CYP2D6*17含有三個氨基酸替換位點(T107I，R296C和S486T)在非洲

4、黑人和美洲黑人中的分布頻率高達15～34％。為了研究這這三個等位基因上的SNPs導致的單個氨基酸替換對等位基因酶在藥物代謝和DDI中的影響，通過定點突變PCR，以CYP2D6*1(野生型)cDNA為模板，構(gòu)建了四個單位點突變體：P34S，T107I，R296C和$486T及三個等位基因突變體CYP2D6*2(雙突變體)，CYP2D6*10(雙突變體)和CYP2D6*17(三突變體)。CYP2D6*1cDNA和各個突變體的cDNA整合進p

5、YES2/CT載體，在釀酒酵母表達系統(tǒng)中誘導表達，通過差速離心法制備酵母微粒體酶，Western鑒定CYP2D6酶的表達，一氧化碳差示光譜法對CYP2D6酶進行定量。分別以熒光底物AMMC和藥物探針底物丁呋洛爾對CYP2D6*1及各個突變株進酶動力學分析，求得米氏常數(shù)。最后再以熒光高通量和HPLC兩種檢測方法對23種藥物對CYP2D6*1及各個突變體進行體外的藥物抑制篩選實驗。 在本實驗中，CYP2D6*1轉(zhuǎn)化AMMC形成AMH

6、C和氧化丁呋洛爾生成1—羥—丁呋洛爾的Vmax分別為31.14pmol/min/mg和175.31pmol/min/mg。四個單位點突變體中的P34S轉(zhuǎn)化AMMC和丁呋洛爾的Vmax降低到CYP2D6*1的36.97-51.44％和14.85-23.43％，而T107I、R296C和S486T三個單點突變體轉(zhuǎn)化AMMC和丁呋洛爾的Vmax和CYP2D6*1相當。CYP2D6*2轉(zhuǎn)化AMMC和丁呋洛爾的Vmax和CYP2D6*1相當，R2

7、96C和S486T兩個氨基酸的單獨替換和組合都對CYP2D6酶活性沒有影響。CYP2D6*10轉(zhuǎn)化AMMC和丁呋洛爾的Vmax和CYP2D6*1相比降低到16.13～32.25％和10.28～12.57％，P34S單氨基酸位點的替換是CYP2D6*10酶活性降低的主要因素，$486T對CYP2D6*10的酶活性的降低貢獻很小。CYP2D6*17轉(zhuǎn)化AMMC和丁呋洛爾的Vmax降低到CYP2D6*1的49.35～51.61％和41.14～

8、58.85％，T107I、R296C和S486T單位點突變對CYP2D6酶的活性沒有影響，而三個位點的組合卻使CYP2D6*17的酶活性顯著降低。用熒光高通量方法和藥物探針底物加HPLC的傳統(tǒng)篩選方法對CYP2D6*1及其突變體同23種藥物在體外進行藥物抑制實驗，同一種藥物對CYP2D6*1和CYP2D6*2，CYP2D6*10，CYP2D6*17的抑制程度沒有表現(xiàn)出明顯的差異。而不同種的藥物對CYP2D6酶的抑制能力表現(xiàn)出明顯的差異，