重組人CYP2D6的體外表達(dá)、活性研究及其在藥物篩選中的初步應(yīng)用.pdf_第1頁(yè)
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1、人細(xì)胞色素2D6是藥物代謝酶P450家族中一種重要的成員,也是最具多態(tài)性的CYP酶之一,其基因的多態(tài)性導(dǎo)致酶活性的增高,降低或者喪失,在表型上表現(xiàn)為弱代謝,中間代謝與強(qiáng)代謝三種。CYP2D6在肝臟中的含量不到5%,但臨床上常用藥物近30%由此酶代謝。本研究克隆CYP2D6野生株州ld type,WT)及五個(gè)單核苷酸突變株(single nucleotide polymorphisms,SNPs)A237S,E418Q,R343G T10

2、71和V11M的cDNA到半乳糖可誘導(dǎo)的表達(dá)載體pYES2/CT中,利用釀酒酵母表達(dá)重組酶,通過(guò)免疫印跡雜交驗(yàn)證目的蛋白表達(dá),進(jìn)而用CYP2D6的傳統(tǒng)探針底物丁呋洛爾和相對(duì)特異性的熒光底物AMMC檢測(cè)重組酶的活性,比較不同SNPs與WT‘在代謝這兩種底物的酶動(dòng)力學(xué)方面的差異,并利用高通量的熒光檢測(cè)技術(shù)對(duì)23種藥物進(jìn)行抑制篩選。成功地建立了穩(wěn)定的P450酶的異源表達(dá)系統(tǒng),初步搭建了在體外利用重組P450酶進(jìn)行藥物代謝研究的平臺(tái)。

3、通過(guò)PCR方法從商品化的質(zhì)粒中獲得CYP2D6野生株的cDNA(全長(zhǎng)約為1.5kbp),克隆到半乳糖可誘導(dǎo)的表達(dá)載體pYES2/CT中。以野生株的eDNA為模板,利用PCR定點(diǎn)突變的方法引入單核苷酸突變位點(diǎn),由此獲得五株SNPs的eDNA。將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pYES2/CT-CYP2D6及其五株SNPs轉(zhuǎn)化到釀酒酵母中,誘導(dǎo)表達(dá)重組酶蛋白,通過(guò)Westernblotting驗(yàn)證目的蛋白表達(dá)。 在驗(yàn)證目的蛋白得到表達(dá)之后,大量誘導(dǎo)

4、重組CYP2D6蛋白,通過(guò)機(jī)械裂解法破碎酵母細(xì)胞,進(jìn)一步通過(guò)差速離心法獲得蛋白微粒體。利用Bradford assay測(cè)定微粒體中的蛋白含量。 取適量微粒體蛋白與CYP2D6相對(duì)特異性熒光底物AMMC及傳統(tǒng)的探針底物丁呋洛爾分別進(jìn)行酶動(dòng)力學(xué)反應(yīng),通過(guò)熒光檢測(cè)技術(shù)與高效液相色譜方法分析,反應(yīng)在產(chǎn)物的生成量與酶濃度及反應(yīng)時(shí)間都成線性的條件下進(jìn)行。 利用熒光檢測(cè)技術(shù)篩查了抗抑郁藥等8類23種藥物,其中抗抑郁藥物氟西汀,舍曲林,

5、氯丙咪嗪,阿米替林和抗精神病類藥物氯丙嗪,硫利達(dá)嗪對(duì)CYP2D6的野生株及突變株都表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用;抗糖尿病藥和降膽固醇類藥物對(duì)CYP2D6都無(wú)抑制作用;同一種藥物對(duì)不同SNPs的抑制程度不盡相同。用HPLC分析了上述23種藥對(duì)CYP2D6野生株催化代謝丁呋洛爾的抑制情況,結(jié)果表明這些藥物對(duì)兩種底物的作用基本是一致的。 本研究成功地克隆了CYP2D6野生株及5個(gè)單核苷酸突變株的eDNA,并構(gòu)建了酵母表達(dá)體系。利用高通量的熒光

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