人CYP2D6的基因多態(tài)性及與藥物代謝關系的研究.pdf

1、藥物代謝主要在肝臟，依賴于肝微粒體中的多種酶系，最重要的是細胞色素P450混合功能氧化酶。CYP450的基因多態(tài)性是造成藥物不良反應的主要原因。孫忠實教授報道藥物不良反應造成的死亡率日益升高。 在過去的幾十年里，藥物研發(fā)中對化合物代謝性質的篩選放在臨床前研究的動物實驗研究階段。這種藥物研發(fā)模式存在著很大的缺陷，不同的種屬動物與人之間存在著很大的差異，尤其是在代謝方面，參與化合物代謝的酶種類、酶的貢獻程度、反應類型以及代謝產物等均

2、可能不相同，把動物實驗結果外推到人體誤差高且準確性低，同時，通量低、價格成本高。隨著分子生物學、基因組學、蛋白質組學、生物信息學的發(fā)展，使藥物研發(fā)的上游基礎技術有了極大的突破．采用人源組織或人源酶的體外實驗，花費少、周期短、能提供大量的信息，最重要的是還能去除種屬差異的影響。本文將CYP450酶建立起體外篩選體系，進行體外代謝數據和性質到體內代謝數據和性質的預測，具有了高通量、高效率、高準確性的特點。 具體方法是以市售CYP2D

3、6 WT的cDNA作為模板，經PCR擴增后，構建pYES2/CT-WT重組質粒；然后利用PCR定點突變的方法分別引入8個單點突變位點；測序確定序列完全正確后，將質粒以電穿孔法轉化至整合了POR基因的釀酒酵母菌株BJ5628，半乳糖誘導表達CYP2D6蛋白，經裂解、差速離心提取CYP2D6微粒體后，連續(xù)光譜熒光儀上用CYP2D6的特異底物AMMC測定酶的活性，得到酶動力學參數Km、Vman，并用非線性回歸做圖；然后選用12種臨床常用藥做藥

4、物抑制實驗，測定IC50。 結果顯示全序列測序證明正確獲得了8株單點突變的DNA(R28C，P34S，L91M，R173C，R201H，H324P,E410K,R440H)，Western-blotting用針對重組酶C端的V5免疫標記的特異抗體證明了CYP2D6蛋白的表達成功。熒光檢測法的活性檢測結果表明不同的SNP的活性不同，其Km，Vmax，及Vmax/Km的值均有差異。其中H324P，R440H完全沒有活性；P34S的活