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文檔簡介
1、CYP2B6是細(xì)胞色素P450家族中CYP2B亞家族的主要成員,其含量約占肝臟CYP總量的0.2%~6%,參與臨床約7%藥物的代謝。CYP2B6對藥物的代謝具有較大的個體差異。目前認(rèn)為CYP2B6的基因多態(tài)性可能是引起個體差異的主要原因,但相關(guān)研究多數(shù)在人體體內(nèi)和重組酶體系展開,前者不能單一反映代謝過程,后者與人體內(nèi)環(huán)境相差較遠(yuǎn),而人肝是與人體最為接近的體外代謝平臺。
本研究擬以肝功能正常的人肝標(biāo)本為研究對象,考察基因多態(tài)性對
2、CYP2B6代謝活性的影響,以期為臨床合理應(yīng)用CYP2B6底物提供理論依據(jù)。
1、材料與方法
1.1人肝酶動力學(xué)參數(shù)的測定
采用差速離心法制備人肝微粒體,Bradford法測定肝微粒體蛋白含量。選用安非他酮作為CYP2B6的探針?biāo)幬?,并以探針?biāo)幬锏纳镛D(zhuǎn)化程度(TR)作為反應(yīng)速度。
收集肝功能正常的肝標(biāo)本105例,年齡20~75歲,男性和女性分別為35例和70例,有吸煙史和飲酒史的分別為11例和1
3、0例,用藥史顯示近期均未用明顯影響CYP酶活性的藥物。探針?biāo)幬锇卜撬臐舛确秶鸀?8.125~5000μM,孵育體系中蛋白濃度均為0.5mg·ml-1,孵育時間均為60min,測定105例人肝的酶動力學(xué)參數(shù)Km、Vmax和CLint。.
1.2安非他酮代謝物羥基安非他酮濃度的測定
采用HPLC-UV測定孵育體系中安非他酮羥基安非他酮的濃度。色譜柱為DiamondC18柱,流動相為乙腈:50mM磷酸二氫鉀(pH3)=
4、21∶79,流速1ml·min-1,檢測μ長214nm。于反應(yīng)體系中加入10μl高氯酸,渦旋離心,上清80μl進(jìn)樣。所建立的測定方法在0.121~3.870μM范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(r>0.999),日內(nèi)、日間變異均<15%,相對回收率均在85%~115%之間,說明所建立的分析方法符合生物樣本的測定要求。
1.3CYP2B6的基因分型
采用DNA提取試劑盒提取肝組織中的DNA。PCR產(chǎn)物直接測序法對多態(tài)性位點(diǎn)CY
5、P2B6*4(785A>G)、CYP2B6*6(516G>T、785A>G)及CYP2E1*9(516G>T)進(jìn)行基因分型。
1.4統(tǒng)計方法
采用GraphPadPrism5.0軟件計算酶動力學(xué)參數(shù),SPSS17.0軟件對各項數(shù)據(jù)資料進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。不同基因型酶動力學(xué)參數(shù)的比較采用非參數(shù)檢驗,檢驗水準(zhǔn)α為0.05。
2、結(jié)果
2.1人肝CYP2B6酶動力學(xué)參數(shù)
以安非他酮為底物,人肝中C
6、YP2B6的酶動力學(xué)參數(shù)Km、Vmx及CLint(中位數(shù),范圍)分別為(73.4,17.1~393.3)μM、(54.8,12.8~333.5)pmol·min-1·mg-1protein及(0.77,0.13~5.22)μl·min-1·mg-1protein,個體差異可達(dá)23~40倍。
2.2性別、年齡、吸煙及飲酒對人肝CYP2B6酶動力學(xué)參數(shù)的影響
統(tǒng)計分析結(jié)果顯示,受試者的性別、年齡、吸煙及飲酒對肝臟CYP2
7、B6酶動力學(xué)參數(shù)均無明顯影響。
2.3基因多態(tài)性對人肝CYP2B6酶動力學(xué)參數(shù)的影響
根據(jù)基因分型的綜合結(jié)果,105例病例可分為7種基因型,即CYP2B6*1/*1、*1/*4、*1/*6、*4/*6、*1/*9、*4/*4和*6/*6,其中基因型CYP2B6*1/*9、*4/*4和*6/*6攜帶者各1例。統(tǒng)計結(jié)果顯示,和野生型相比,CYP2B6*1/*6的攜帶者Km明顯增大,Vmax明顯降低,CLint明顯降低(P
8、<0.05)。而基因型*1/*9者Vmax和CLint有明顯較大(均為*1/*1攜帶者中位數(shù)的5.9倍);基因型*4/*4者Km明顯較大(為*1/*1攜帶者中位數(shù)的6.0倍),Vmax和CLint明顯較小,但均因病例數(shù)較少,無法進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。
結(jié)論:
1.性別、年齡、吸煙及飲酒對人肝CYP2B6代謝活性無明顯影響。
2.CYP2B6*1/*6攜帶者人肝微粒體CYP2B6代謝活性明顯降低。
3.C
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