人CYP450 3A4酵母表達系統(tǒng)的建立及其多態(tài)性等位基因在體外代謝研究中的初步應用.pdf

1、人類細胞色素P450(Cytochrome P450，CYP)是代謝許多重要的內(nèi)源性和外源性化合物及其前致癌物的一類氧化酶。其中CYP3A4是最重要的P450酶之一，參與45-60％常用藥物在體內(nèi)的代謝轉(zhuǎn)化過程。CYP3A4酶活性具有明顯的個體差異，不僅表現(xiàn)為肝臟表達水平差異高達40倍，且其底物的體內(nèi)代謝也可相差10倍左右。在CYP3A4活性的個體差異中，基因作用占60--90％，其中最主要的原因是CYP3A4的基因多態(tài)性。目前，許多C

2、YP3A4等位基因已被發(fā)現(xiàn)，并進一步證實是造成個體之間藥物代謝差異的一個重要因素。 選取7個天然存在的SNPs，利用PCR定點突變方法在CYP3A4野生型基因中引A,SNPs，選擇適合酵母表達體系的載體pYES2/CT進行基因克隆。測序后，用半乳糖誘導重組子在酵母系統(tǒng)中進行表達，采用差速離心法制備含CYP3.A4重組酶的S9微粒體。并用CYP3A4特異性熒光底物DBF(Dibenzylfluorescein)和BOMCC以及其探

3、針底物nifedipine進行酶催化活性和動力學的實時檢測，所得的數(shù)據(jù)可用非線性回歸分析法計算Km值和Vmax值。同時使用CYP3A4野生型及其7個SNPs突變株微粒體蛋白在該系統(tǒng)中對六大類共8種藥物進行高通量篩選，以便研究單核苷酸多態(tài)性對藥物代謝的影響。 對CYP3A4野生型及其突變株的研究表明：用釀酒酵母表達人的藥物代謝酶是研究與藥物代謝相關(guān)問題的一個很好途徑。微粒體熒光檢測和色譜檢測結(jié)果顯示，CYP3A4野生型具有較強催化

4、活性，獲得的酶動力學參數(shù)‘Vmax和Km與已公布的相近。另外，與CYP3A4野生型相比，突變株R1 62Q，L293P，M445T和P467S代謝底物的能力沒有顯著改變，而T185S，F(xiàn)189S和$222P的活力均有不同程度的下降，其中F189S的活力最低，達到CYP3A4野生株的1/10。對六大類共8種藥物進行高通量篩選可以看出，同種藥物對不同種重組酶的抑制程度不同，不同種藥物對同一種重組酶的作用情況也不相同。但總的來說，各種藥物對C