青霉素過(guò)敏反應(yīng)與IL-12、IL-18、IL-8R的表達(dá)及其基因多態(tài)性的研究.pdf

1、青霉素類(lèi)抗生素是一類(lèi)高效、低毒的抗生素,但由青霉素類(lèi)抗生素引起的過(guò)敏反應(yīng)在臨床藥物引起的過(guò)敏反應(yīng)中,發(fā)生率居于首位,嚴(yán)重者甚至可引起過(guò)敏性休克乃至死亡病例的出現(xiàn)。血清總IgE或特異性IgE的升高是青霉素過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生的重要特征。早期對(duì)于青霉素類(lèi)抗生素引起過(guò)敏反應(yīng)的研究認(rèn)為:其主要是由特異性IgE抗體所介導(dǎo)而引發(fā)的Ⅰ型超敏反應(yīng),且已研究表明,特異性IgE抗體是介導(dǎo)過(guò)敏反應(yīng)的關(guān)鍵。隨著對(duì)其研究的深入,認(rèn)為T(mén)細(xì)胞在青霉素類(lèi)抗生素誘發(fā)的速發(fā)型、遲

2、發(fā)型過(guò)敏反應(yīng)中均有重要作用。目前,青霉素類(lèi)藥物過(guò)敏反應(yīng)的預(yù)測(cè)和診斷主要是采用皮內(nèi)試驗(yàn)法。該方法簡(jiǎn)便易行,但缺點(diǎn)在于因病人個(gè)體差異、皮試藥劑成分不同和結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)的掌握尺度不一等諸多因素的影響,造成假陽(yáng)性和假陰性率較高；尤其是對(duì)于部分高敏患者,在皮試過(guò)程即可發(fā)生休克甚至死亡。因此,開(kāi)發(fā)青霉素類(lèi)藥物過(guò)敏的體外診斷方法日益受到各國(guó)科研人員的重視。
　　 青霉素過(guò)敏和抗青霉素特異性抗體有密切關(guān)系,其抗青霉素類(lèi)抗生素特異性抗體是由B細(xì)胞產(chǎn)

3、生,該過(guò)程受到不同的T淋巴細(xì)胞亞群分泌的多種細(xì)胞因子復(fù)雜交叉的調(diào)控。此外,青霉素過(guò)敏也不再僅限于由于IgE介導(dǎo)的Ⅰ型超敏反應(yīng),其過(guò)敏反應(yīng)也涉及到其它幾種類(lèi)型的超敏反應(yīng)的發(fā)生,這些超敏反應(yīng)也受到多種細(xì)胞因子的分泌的影響,從而進(jìn)行著復(fù)雜而又交叉的調(diào)節(jié)和控制。
　　 現(xiàn)在隨著對(duì)免疫相關(guān)分子與青霉素過(guò)敏關(guān)系研究的深入,發(fā)現(xiàn)許多因子與過(guò)敏性疾病相關(guān)。然而,更多的候選基因以及這些候選基因的遺傳變異在青霉素過(guò)敏反映中的作用還遠(yuǎn)未被認(rèn)識(shí)。在本研

4、究中選取了IL-12和IL-18細(xì)胞因子,它們都是目前研究較為熱點(diǎn)的細(xì)胞因子,并且它們與臨床免疫相關(guān)疾病關(guān)系密切。
　　 本研究以青霉素過(guò)敏病人為研究對(duì)象,用RAST的方法測(cè)定了青霉素過(guò)敏病人中針對(duì)青霉素類(lèi)分子主次要抗原決定簇的8種特異性IgE水平,使用ELISA方法測(cè)定青霉素過(guò)敏病人中血清IL-18和IL-12的水平,PCR-SSP的方法對(duì)人群中的IL-12基因和IL-18基因的基因多態(tài)性進(jìn)行了分析,同時(shí)從青霉素過(guò)敏病人與正常

5、對(duì)照間的差異基因表達(dá)的結(jié)果中挑選出IL-8R,對(duì)其在外周血白細(xì)胞中表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)。從而與所測(cè)得的病人體內(nèi)的青霉素特異性抗體水平相比較,對(duì)IL-12、IL-18以及IL-8R在青霉素類(lèi)抗生素過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生中的作用和地位加以討論,從而為更好的預(yù)防、診斷和治療青霉素過(guò)敏提供參考依據(jù)。
　　 目的：評(píng)價(jià)RAST方法在青霉素類(lèi)抗生素過(guò)敏反應(yīng)診斷中的可靠性,分析青霉素類(lèi)抗生素的交叉過(guò)敏反應(yīng)情況；探討側(cè)鏈結(jié)構(gòu)在交叉過(guò)敏反應(yīng)中的重要性。

6、>　　 方法：制備抗原決定簇紙片:制備連接青霉素G(PG)、青霉素V(PV)、阿莫西林(AX)和氨芐西林(AMP)四種藥物的主、次要抗原決定簇的抗原紙片。PG、PV、AMP、AX的主、次要抗原決定簇分別為:BPO-PLL和BPA-PLL,PVO-PLL和PVA-PLL,APO-PLL和APA—PLL,AXO-PLL和AXA—PLL。選取614例正常對(duì)照人群和606例青霉素過(guò)敏病人,引起過(guò)敏的藥物為PG、PV、AMP和AX。使用RAST

7、方法對(duì)青霉素過(guò)敏病人和正常對(duì)照組的以上8種特異性IgE水平,以正常對(duì)照組的(x)±2.33s制定標(biāo)準(zhǔn)值,病人組中高于此上線即定義為IgE陽(yáng)性。根據(jù)病人皮試情況、皮試或用藥后出現(xiàn)的過(guò)敏癥狀、出現(xiàn)癥狀的時(shí)間以及病人的年齡性別等進(jìn)行分組,比較不同組間IgE水平及陽(yáng)性率情況。
　　 結(jié)果：本實(shí)驗(yàn)制成的紙片與國(guó)外參比紙片無(wú)明顯差異(P<0.05)；同時(shí)使用主次要抗原決定簇特異性IgE抗體的檢測(cè)較單用主要抗原決定簇時(shí)的41.9％檢出率,增加

8、至63.7％；BPO-IgE、PVO-IgE、BPA—IgE和PVA-IgE水平隨青霉素過(guò)敏病人年齡升高有升高的趨勢(shì)；特異性IgE水平與性別無(wú)關(guān)；BPO-IgE和BPA-IgE的水平與出現(xiàn)過(guò)敏癥狀病人的皮試結(jié)果相關(guān)；對(duì)青霉素G和青霉素V的IgE水平與用藥后出現(xiàn)的呼吸困難癥狀有關(guān)；針對(duì)青霉素IgE陽(yáng)性與皮試陰陽(yáng)性及皮試后癥狀有關(guān)系；在四種青霉素類(lèi)藥物中,在使用青霉素G后更易發(fā)生過(guò)敏癥狀；在使用次要抗原決定簇的病人皮試后是否出現(xiàn)過(guò)敏癥狀無(wú)密

9、切相關(guān)；青霉素過(guò)敏病人體內(nèi)IgE水平隨時(shí)間有下降趨勢(shì)。
　　 結(jié)論：本研究中所制備的青霉素類(lèi)藥物抗原紙片,經(jīng)過(guò)驗(yàn)證,其敏感性、特異性和穩(wěn)定性較好,能較好檢出病人血清中IgE水平；同時(shí)使用主、次要抗原決定簇特異性IgE抗體的檢測(cè),能提高過(guò)敏病人的檢出陽(yáng)性率；四種青霉素類(lèi)藥物中青霉素G的IgE抗體陽(yáng)性與出現(xiàn)過(guò)敏癥狀的青霉素皮試陽(yáng)性更密切；青霉素過(guò)敏病人中,體內(nèi)特異性IgE水平隨時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。
　　 目的：測(cè)定正常人和青霉

10、素過(guò)敏病人中血清IL-18和IL-12的水平,探討IL-18和IL-12在青霉素類(lèi)抗生素過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生中的作用和地位。
　　 方法：依照青霉素過(guò)敏的診斷原則,即皮試陽(yáng)性或皮試陰性但在應(yīng)用青霉素類(lèi)藥物后出現(xiàn)臨床癥狀的原則選擇青霉素過(guò)敏病人,以ELISA的方法檢測(cè)青霉素過(guò)敏病人和正常對(duì)照人群中血清IL-18和IL-12的水平。
　　 結(jié)果：青霉素過(guò)敏病人組IL-18和IL-12水平均較正常人組升高(102.8pg／ml vs6

11、7.9pg／ml,15.8ng／ml vs13.5ng／ml,P<0.05)；出現(xiàn)休克、呼吸困難、蕁麻疹等不同過(guò)敏癥狀青霉素過(guò)敏病人中血清IL-18和IL-12水平均較正常人升高,但不同癥狀間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05):皮試或用藥后出現(xiàn)癥狀的青霉素過(guò)敏病人中IL-18水平較正常人升高(P<0.05),但僅皮試陽(yáng)性而無(wú)癥狀的青霉素過(guò)敏病人中IL-18水平與正常人相比無(wú)明顯變化(P>0.05)；在用藥后出現(xiàn)癥狀的青霉素過(guò)敏病人中,皮試陰性

12、者血清IL-12水平較皮試陽(yáng)性者升高(P<0.05)；在速發(fā)型和遲發(fā)型過(guò)敏病人間血清IL-12和IL-18水平均無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；出現(xiàn)不同特異性IgE抗體陽(yáng)性種類(lèi)數(shù)的青霉素過(guò)敏病人間IL-12和IL-18水平無(wú)明顯差異；在青霉素過(guò)敏病人組和正常人組內(nèi),血清IL-12和IL-18水平存在正相關(guān)(P<0.05)。
　　 結(jié)論：青霉素過(guò)敏病人組血清IL-18和IL-12水平均較正常人組升高,且其水平的升高和青霉素過(guò)敏的發(fā)生相關(guān)。青霉素

13、過(guò)敏病人是否會(huì)出現(xiàn)臨床癥狀與IL-18水平升高有關(guān),皮試情況與IL-12水平相關(guān),但在皮試或用藥后出現(xiàn)何種臨床癥狀與IL-12和IL-18水平無(wú)關(guān)。無(wú)論在青霉素過(guò)敏病人還是在正常人中,IL-12和IL-18水平存在正相關(guān)。
　　 目的：以PCR—SSP技術(shù)檢測(cè)青霉素過(guò)敏病人中IL-18基因和IL-12B基因的基因多態(tài)性(SNP),探討IL-18和IL-12B基因SNP與青霉素過(guò)敏的關(guān)系。
　　 方法：選取IL-18基因啟

14、動(dòng)子區(qū)的-607A／C和-137G／C位點(diǎn)以及IL-12B啟動(dòng)子區(qū)的-6415(CTCTAA／GC)位點(diǎn)和3’非翻譯區(qū)10841(C／A)位點(diǎn),依照相應(yīng)位點(diǎn)的多態(tài)性堿基類(lèi)型設(shè)計(jì)相應(yīng)的針對(duì)該位點(diǎn)的特異性PCR引物(-607A和-607C,-137G和-137C,-6415C和-6415G,10841C和10841A),使該引物3’端堿基恰好位于該多態(tài)性位點(diǎn)并與其相匹配,同時(shí)也設(shè)計(jì)與該特異性引物相匹配的配對(duì)引物(607R、137R,-641

15、5F、10841R)及陽(yáng)性擴(kuò)增用對(duì)照引物(607F、137F,-6415R、10841F)。提取青霉素過(guò)敏病人和正常對(duì)照人外周血單個(gè)核細(xì)胞基因組DNA,以其為模板,選用上述特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增情況,看是否在特定的PCR引物中出現(xiàn)相應(yīng)的PCR產(chǎn)物。同時(shí)選取一定數(shù)量的PCR進(jìn)行測(cè)序分析,以驗(yàn)證PCR-SSP的準(zhǔn)確性。
　　 結(jié)果：
　　 1.使用相應(yīng)位點(diǎn)特異性引物均能擴(kuò)增出相應(yīng)大小的PCR產(chǎn)

16、物,但該特異性引物不是該位點(diǎn)匹配堿基時(shí)則無(wú)PCR產(chǎn)物出現(xiàn)；并且經(jīng)DNA測(cè)序分析,本研究采用的PCR-SSP能準(zhǔn)確反映待檢DNA中IL-18-607A／C和-137G／C位點(diǎn)以及IL-12啟動(dòng)子區(qū)的-6415(CTCTAA／GC)位點(diǎn)和3’非翻譯區(qū)10841(C／A)位點(diǎn)的多態(tài)性情況。
　　 2.IL-18-607A／C和-137G／C以及IL-12-6415(CTCTAA／GC)和10841(C／A)四個(gè)位點(diǎn)SNP在對(duì)照組均符合

17、Hardy-Weinberg平衡分布。
　　 3.IL-18-607位點(diǎn)AA基因型及A等位基因在青霉素過(guò)敏病人中所占比例高于正常組(15.5％ vs9.0％,P<0.01；42.1％ vs32.5％,P<0.01)。IL-18-137位點(diǎn)GG基因型和G等位基因在青霉素過(guò)敏病人中所占比例低于正常組(69.3％ vs81.3％,P<0.01；84.2％ vs90.5％,P<0.01)。IL-18-607A／C位點(diǎn)和IL-18-137

18、G／C位點(diǎn),各基因型在皮試陰陽(yáng)性組間、不同青霉素過(guò)敏癥狀組間、速發(fā)或遲發(fā)的過(guò)敏類(lèi)型間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 4.IL-12B-6415位點(diǎn)GC／GC的基因型和GC等位基因在青霉素過(guò)敏病人中所占比例高于正常組(37.6％ vs18.8％,.P<0.01；53.9％ vs47.7％,P<0.05)。IL-12B10841位點(diǎn),在青霉素過(guò)敏病人中的CC基因型頻率高于正常對(duì)照組(35.4％ vs22.5％,P<0.05)。IL-12

19、-6415(CTCTAA／GC)位點(diǎn),各基因型在皮試陰陽(yáng)性間、不同青霉素過(guò)敏癥狀組間、速發(fā)或遲發(fā)的過(guò)敏類(lèi)型間均無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。IL-12B10841(C／A)位點(diǎn),在蕁麻疹病人中CC基因型所占比例和C等位基因頻率均較對(duì)照組明顯升高(40.4％ vs22.5％,P<0.05,62.9％ vs50.4％,P<0.05)。
　　 5.應(yīng)用SHEsis軟件平臺(tái)進(jìn)行連鎖不平衡分析,IL-18-607A／C和-137G／C位點(diǎn)間不存在連鎖

20、不平衡(D'=0.223)；IL-12B-6415 CTCTAA／GC和10841C／A位點(diǎn)間也不存在連鎖不平衡(D'=0.203)。
　　 6.應(yīng)用SHEsis軟件平臺(tái)對(duì)各位點(diǎn)進(jìn)行單倍體分析,IL-18基因的AC型單倍體(-607A／-137C)在過(guò)敏病人中的頻率顯著高于正常人(P<0.01),而CG型單倍體(-607C／-137G)在正常對(duì)照組的頻率則顯著高于過(guò)敏病人組；IL-12B基因的GC／C型單倍體(-6415GC／1

21、0841C)在過(guò)敏病人中的頻率顯著高于正常人(P<0.01),而CTCTAA／A型單倍體(-6415CTCTAA／10841A)在正常對(duì)照組的頻率則顯著高于過(guò)敏病人組。
　　 7.在過(guò)敏病人組和對(duì)照組內(nèi)IL-18-607位點(diǎn)上AA、AC、CC基因型間的血清IL-18水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在過(guò)敏病人組IL-18-137位點(diǎn)GG、GC及CC基因型間比較血清IL-18水平發(fā)現(xiàn),GG組的血清IL-18水平明顯低于GC+C

22、C組(P<0.05),在對(duì)照組則無(wú)差別。
　　 8.在過(guò)敏病人組和對(duì)照組內(nèi)的IL-12B基因-6415位點(diǎn)或10841位點(diǎn)上的各基因型間的血清IL-12水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.IL-18啟動(dòng)子區(qū)的-607C／A位點(diǎn)上A等位基因、137G／C位點(diǎn)上C等位基因和青霉素過(guò)敏易感性相關(guān)。IL-12B-6415CTCTAA／GC位點(diǎn)上GC／GC基因型和1084.1C／A位點(diǎn)上CC基因

23、型和青霉素過(guò)敏易感性相關(guān)。
　　 2.IL-18-607A／C位點(diǎn)和IL-18-137G／C位點(diǎn)的各基因型與青霉素病人的皮試情況、青霉素過(guò)敏癥狀及過(guò)敏類(lèi)型無(wú)關(guān)。
　　 3.IL-12-6415(CTCTAA／GC)位點(diǎn)的各基因型與青霉素病人在皮試情況、青霉素過(guò)敏癥狀及過(guò)敏類(lèi)型無(wú)明顯相關(guān)性。IL-12B10841(C／A)位點(diǎn)上為CC基因型時(shí),該青霉素過(guò)敏病人傾向于出現(xiàn)蕁麻疹的癥狀。
　　 4.青霉素過(guò)敏病人中IL

24、-18-607A／C和-137G／C位點(diǎn)間、IL-12B-6415CTCTAA／GC和10841 C／A位點(diǎn)間均不存在連鎖不平衡。
　　 5.IL-18基因的-607A／-137C單倍體型和IL-12B基因的-6415GC／10841C單倍體型是發(fā)生或促進(jìn)青霉素過(guò)敏的危險(xiǎn)因素。
　　 6.IL-18基因啟動(dòng)子區(qū)域的-607位點(diǎn)基因多態(tài)性對(duì)IL-18血清水平無(wú)明顯影響；-137位點(diǎn)的多態(tài)性對(duì)IL-18水平有一定的調(diào)控作用,

25、其GG基因型可降低IL-18表達(dá)水平。IL-12B基因啟動(dòng)子區(qū)域的-6415位點(diǎn)和10841位點(diǎn)基因多態(tài)性與IL-12在血清水平無(wú)關(guān)。
　　 目的:通過(guò)基因芯片技術(shù)探索在青霉素過(guò)敏病人與正常人間差異基因的表達(dá),從中挑選與細(xì)胞因子相關(guān)分子,進(jìn)一步探索該分子在青霉素過(guò)敏中的表達(dá)情況及作用。
　　 方法:采集青霉素過(guò)敏病人及對(duì)照人群的外周血并分離其單個(gè)核細(xì)胞。以表達(dá)譜基因芯片技術(shù)檢測(cè)青霉素過(guò)敏病人和正常人間的外周血單個(gè)核細(xì)胞的

26、差異基因表達(dá)情況。選取與細(xì)胞因子相關(guān)的分子IL-8R,以熒光定量RT-PCR及Western Blot檢測(cè)青霉素過(guò)敏病人及對(duì)照人群的外周血中IL-8RA和IL-8RB的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:
　　 1.表達(dá)譜基因芯片發(fā)現(xiàn)青霉素病人組和正常對(duì)照間共有3294條(1731條高表達(dá),1563條低表達(dá))差異表達(dá)基因；其中差異明顯的有1994條,和免疫相關(guān)的基因有338條；其中IL-8R這一與細(xì)胞因子相關(guān)分子在青霉素病人組較對(duì)照

27、組明顯升高(平均信號(hào)強(qiáng)度比值為3.49)。
　　 2.熒光定量RT-PCR和Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在皮試陰性的青霉素過(guò)敏病人IL-8RA mRNA和蛋白表達(dá)量較正常組升高(P<0.05),其中呼吸困難組和蕁麻疹組的升高更為明顯(P<0.01)；IL-8RB mRNA表達(dá)量在皮試陰性的各癥狀組也均無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)差異(P>0.05)。
　　 3.在青霉素過(guò)敏病人的遲發(fā)型組中的IL-8RA mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯高

28、于對(duì)照組(P<0.05)；無(wú)論在遲發(fā)型或速發(fā)型組IL-8RB mRNA和蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組相比均無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.以表達(dá)譜基因芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)了青霉素病人和正常對(duì)照間大量的差異表達(dá)基因,為后續(xù)探討青霉素過(guò)敏機(jī)制提供了候選基因的篩選。
　　 2.青霉素過(guò)敏病人外周血單個(gè)核細(xì)胞存在IL-8RA的高表達(dá),其表達(dá)水平的升高是青霉素過(guò)敏病人出現(xiàn)蕁麻疹和呼吸困難的促進(jìn)因素,且傾向于出現(xiàn)