內皮祖細胞組織因子沉默效應及其對內毒素血癥裸鼠凝血、炎癥影響的實驗研究.pdf

1、研究背景和目的： 心腦血管血栓形成占血栓性疾病發(fā)病率的第一位，具有極高的病死率和致殘率。隨著研究的不斷深入，血管、血液動力學及血液成分異常凸顯出其發(fā)病學意義。 本研究著眼于內皮的損傷修復，探討急性心肌梗死及急性腦梗死患者TF表達的改變；采用新近發(fā)展的RNAi技術(RNAinterference，RNAi)針對促凝、致炎的關鍵基因TF進行干預，設計shRNA，包裝成慢病毒，感染人臍靜脈血管內皮細胞進行干擾效率的鑒定；感染人

2、臍血內皮祖細胞，進行干擾效率鑒定并對TF基因沉默的EPCs進行生物學特性檢測，以期篩選出干擾效率最高、副作用最小的慢病毒，并系統(tǒng)觀察細胞不同分化階段內皮祖細胞、內皮細胞TF表達改變情況；探討TF基因沉默的內皮祖細胞移植對內毒素血癥裸鼠凝血炎癥的影響，以期為細胞治療結合基因治療在臨床心血管疾病的應用提供新思路及理論依據(jù)。 方法： 1、急性心肌梗死及腦梗死患者組織因子、組織因子途徑抑制物的檢測及臨床意義： 觀察分析6

3、9例急性心肌梗死、71例急性腦梗死患者以及50名健康老年人血漿中組織因子、組織因子途徑抑制物的表達。TF和TFPI活性測定采用發(fā)色底物法，抗原測定用ELISA法。 2、慢病毒攜帶shRNA對內皮細胞組織因子表達的抑制作用： 利用在線軟件設計2個位點的TF干擾序列。采用U6慢病毒表達載體系統(tǒng)構建目標基因TF的慢病毒shRNA表達載體，經測序驗證，在293FT細胞中包裝病毒粒子，病毒包括3種，目標基因TF的TF6和TF2以及

4、陰性對照TFNC。分別對這3個病毒粒子進行滴度測定。內皮細胞屬于誘生性表達TF的細胞，且內皮祖細胞在修復損傷內皮后，也是通過內皮細胞的形式表達其功能，因此，我們采用體外培養(yǎng)的人臍靜脈血管內皮細胞進行感染，利用RT-PCR和ELISA方法進行各感染組的TF表達水平檢測。 3、TF表達沉默對人內皮祖細胞生物學特性的影響： 密度梯度離心法分離人臍血單個核細胞，培養(yǎng)7天后，收集貼壁細胞，采用多波長激光共聚焦顯微鏡鑒定FITC-U

5、EA-I和Dil-acLDL雙染色陽性細胞為正在分化的EPCs：流式細胞儀檢測細胞表型：利用RT-PCR、ELISA方法進行各病毒粒子感染EPCs組TF表達水平檢測；在有效沉默EPCs表達TF的基礎上，MTT比色法檢測EPCs的增殖能力，粘附能力實驗檢測EPCs的粘附能力4、TF表達沉默內皮祖細胞對內毒素血癥裸鼠凝血、炎癥的影響： 裸鼠內毒素腹腔注射制備內毒素血癥模型，尾靜脈輸入EPCs或TF表達沉默EPCs;7天后，觀察動物死

6、亡率：HE染色，觀察肺組織炎癥病理改變；采血，光鏡下計數(shù)紅細胞、白細胞、血小板數(shù)目的改變；血凝儀檢測PT、APTT、TT、Fbg的變化；ELISA方法檢測TF抗原表達情況；分別分離裸鼠外周血單個核細胞、肝臟細胞及脾臟細胞，抽提基因組DNA，PCR擴增，檢測人Alu基因特異性條帶。 結果： 1、疾病組(AMI及ACI)與對照組之間除年齡、性別構成比、吸煙及合并糖尿病外均差異顯著(P<0.001);AMⅠ組與ACⅠ組二組之間

7、，總膽固醇差異不顯著(P=0.073)、低密度脂蛋白差異無統(tǒng)計學意義(P=0.799)，而甘油三酯、高密度脂蛋白二組之間的差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.001)。與對照組相比，AMI患者血漿中TF活性、TF抗原、TFPI活性與TFPI抗原均顯著增加(P<0.001)；ACI患者血漿中TF活性、TF抗原均升高(P<0.001)，TFPI活性、TFPI抗原均降低(P<0.001)。兩病例組相比，AMⅠ組TF活性、抗原升高更為顯著(P<0.00

8、1)；AMⅠ組TFPI活性、抗原增加，而ACⅠ組均降低，差異具有顯著性意義(P<0.001)。 2、根據(jù)TF基因(NM001993)，設計、合成2個不同位點的寡核苷酸片斷，行95℃退火處理，經4％瓊脂糖凝膠電泳檢測得到了退火產物dsOligo，將該產物與pENTRTM／U6連接，轉TOP10感受態(tài)細胞，卡那霉素抗性(50μg/ml)平板篩選陽性克隆，U6前引物(5'-GGACTATCATATGCTrACCG-3')測序結果顯示獲

9、得了陽性克隆。將目標基因陽性克隆質粒與慢病毒載體進行重組，轉化Stb13感受態(tài)細胞，氨芐青霉素(Amp)抗性篩選后，進行30μg／ml氯霉素的LB平板中的藥物負篩選，U6前引物測序再次表明2個位點的重組子均為陽性重組子。將陽性重組子與ViraPowerTM包裝質?；旌衔镌谫|脂體LipofectamineTM2000的介導下，在293FT細胞中包裝病毒，收獲含病毒的上清液，-80℃保存。利用系列稀釋法(10-2～10-6)測定慢病毒貯液滴

10、度，行殺稻瘟菌素(濃度為10μg/ml)藥物篩選，感染的細胞形成肉眼可見的克隆，在顯微鏡下計數(shù)克隆數(shù)，測定病毒的滴度為6×105TU／ml(TransducingUnit／ml)。將2個位點的慢病毒和1個陰性對照對人臍靜脈血管內皮細胞進行RNAi實驗。RT-PCR顯示其中TF2位點TF基因表達較低；ELISA分析結果也顯示TF2位點TF抗原表達水平也較低，也即TF2位點干擾效果最好。 3、流式細胞儀檢測貼壁細胞表面標志，結果顯示

11、表達CD133：17.05±2.94％，CD34：12.37±2.69％，KDR：53.84±5.43％。將2個位點的慢病毒和1個陰性對照對人臍血內皮祖細胞進行RNAi實驗。RT-PCR顯示其中TF2位點TF基因表達較低；ELISA分析結果也顯示TF2位點TF抗原表達水平也較低，也即TF2位點干擾效果最好。MTT法觀察體外TF2位點、TFNC位點慢病毒感染的EPCs以及單純EPCs的增殖情況，結果表明三個組EPCs的生長均隨時間變化而增

12、長，三個組細胞的增殖能力差異無統(tǒng)計學意義(F=0.036，P=0.965)；粘附能力實驗觀察體外TF2位點、TFNC位點慢病毒感染的EPCs以及單純EPCs的粘附能力，結果表明三個組EPCs的粘附能力均隨時間變化而增加，三個組細胞的粘附能力差異無統(tǒng)計學意義(F=0.067，P=0.936). 4、注射內毒素12小時后，即有動物開始死亡，至7日，三個模型組共死亡17只，其中LPS組死亡最多，死亡7只，LPS+EPCs組死亡6只，T

13、F表達沉默的LPS+EPCs+TF2組死亡數(shù)最少，死亡4只；人EPCs移植裸鼠后，人源細胞能分布到裸鼠的各個組織，包括外周血、肝臟和脾臟；對肺組織病理學檢查發(fā)現(xiàn)，模型LPS組動物肺泡結構紊亂，肺間隔明顯增厚，肺泡腔內、肺泡間隔大量炎性細胞浸潤，支氣管上皮細胞脫落，呈現(xiàn)明顯的炎癥反應特征；EPCs移植均能降低LPS引起的肺部炎癥反應，但TF表達沉默的EPCs移植組，炎癥反應較單純的EPCs移植組炎癥反應更輕，肺泡結構改變也更??；三個模型組

14、之間紅細胞、白細胞、血小板數(shù)目均降低，顯著低于對照組(P<0.05)，但模型組之間差異不顯著(P>0.05)；三個模型組PT、APTT、TT均延長，顯著高于對照組(P<0.01)，三個模型組之間PT、APTT、TT差異不顯著(P>0.05)；三個模型組Flag含量降低，顯著低于對照組(P<0.01)，三個模型組之間Fbg差異不顯著(P>0.05)；LPS可引起模型組TF抗原含量升高，EPCs移植可降低模型TF抗原含量，且TF沉默EPCs

15、比單純EPCs降低模型TF的效果更好(P=0.011). 結論： 1、急性心肌梗死和急性腦梗死患者均存在組織因子表達增高，且其組織因子途徑改變并不相同，患者血栓形成風險增加，測定TF、TFPI對了解疾病發(fā)展趨勢具有輔助作用。 2、成功地構建了人TF基因RNAi慢病毒載體，克隆出TF2、TF6和TFNC三個干擾載體，進行慢病毒的包裝和滴度測定，RT-PCR、ELISA顯示其中TF2位點TF干擾效果最好。 3

16、、成功分離、鑒定了人臍血內皮祖細胞，發(fā)現(xiàn)用TF2位點的慢病毒感染EPCs，其TF干擾效果最好；用TF2及TFNC位點的慢病毒感染EPCs不影響體外EPCs增殖能力、細胞粘附能力，提示TF表達沉默的EPCs有望成為既降低TF表達也參與內皮損傷修復的一種全新基因修飾的細胞治療載體。 4、輸入EPCs或TF表達沉默的EPCs對全身系統(tǒng)性凝血功能沒有明顯影響，但TF表達沉默的EPCs降低內毒素血癥模型肺部炎癥反應并降低TF抗原含量的作用

17、要明顯優(yōu)于對照EPCs，有望彌補單用EPCs移植不能阻斷或減緩體內凝血、炎癥過程發(fā)展的不足。 主要創(chuàng)新點： 1、血漿中TF的表達與動脈粥樣硬化、膿毒血癥和DIC等許多病理過程密切相關，由于其在凝血途徑中的啟動效應，“上游”阻斷比“下游”阻斷理論上更具有優(yōu)勢，對這些疾病的預防和治療有著非常重要的臨床意義。 2、首次利用慢病毒載體的方法，系統(tǒng)觀察細胞不同分化階段內皮細胞、內皮祖細胞TF基因的RNAi實驗，為體內外抗凝