肽酰-脯氨酰順反異構(gòu)酶胞內(nèi)活性分析的研究.pdf

1、肽酰-脯氨酰順反異構(gòu)酶胞內(nèi)活性分析的研究摘要肽酰-脯氨酰順反異構(gòu)酶(peptidyl prolyl cis-trans isomerase,PPI)是多家族類蛋白質(zhì),基本功能是與蛋白質(zhì)的脯氨酸殘基結(jié)合,催化Xaa-Pro之間肽鍵的順反異構(gòu)反應(yīng).本研究旨在初步嘗試建立PPI胞內(nèi)活性檢測的方法.基于RNase T1作為體外底物分析PPI活性已取得的研究成果,在探討胞內(nèi)PPI活性的研究中,利用分子生物學(xué)方法開展了一些研究,我們嘗試在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)

2、RNase T1作為PPI的作用底物.來自太平洋的水母(Aequorea vitoria)中的綠色熒光蛋白(green fluorescent protein GFP)是近年來廣泛應(yīng)用的基因標(biāo)簽,但這種野生型的GFP比標(biāo)準(zhǔn)的報(bào)告蛋白(如:β-半乳糖苷酶)的檢測靈敏度還低.其突變體EGFP(enhanced green fluorescent protein EGFP)具有野生型GFP 35倍的熒光強(qiáng)度,可用來指示上游蛋白正確折疊,在該研

3、究中作為指示RNase T1正確折疊的"折疊標(biāo)簽".即用EGFP的綠色熒光標(biāo)記RNase T1的正確折疊(有酶活),而RNase T1的活性來指示PPI的胞內(nèi)活性,在這種設(shè)計(jì)思想下RNase T1是本課題的直接研究對象,而研究目的是間接探討PPI的胞內(nèi)酶活,希望為PPI的胞內(nèi)活性分析奠定基礎(chǔ).我們分別在原核大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)(胞內(nèi)表達(dá))和真核畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)(分泌表達(dá))做了表達(dá)研究探索.構(gòu)建好的融合基因經(jīng)酶切后與pUC18載體連接,連接產(chǎn)

4、物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α.在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)RNase T1、EGFP和RNase T1與EGFP的融合蛋白,結(jié)果表明EGFP在大腸桿菌中獲得可溶性表達(dá),但沒有分離得到RNaseT1,可能由于RNaseT1被胞內(nèi)敏感蛋白酶降解,而去除了它的細(xì)胞毒作用,這與胞內(nèi)表達(dá)RNase T1沒有獲得成功的報(bào)道相一致.SDS-PAGE電泳分析表明,表達(dá)的融合蛋白RNase T1-EGFP僅比單獨(dú)表達(dá)的EGFP分子量稍大,分離純化后沒有RNase T1