黃瓜果瘤和果實無光澤性狀基因的定位與功能分析.pdf

1、黃瓜(Cucumis sativusL.;2n=2x=14)屬于葫蘆科(Cucurbitaceae)家族，是世界上非常重要蔬菜作物之一。果刺和果瘤一起構成了黃瓜果實的刺瘤性狀，按果瘤性狀可將黃瓜果實分為有果瘤和無果瘤兩種類型，由于消費者對黃瓜有無果瘤的外觀性狀存在不同的喜好，因此果瘤性狀影響著黃瓜的市場價值。模式作物擬南芥、水稻，以及甜瓜、西瓜和冬瓜等常見的葫蘆科作物不具有果瘤性狀，目前關于黃瓜果瘤性狀形成的機制還不清楚。
　　遺

2、傳分析表明，果瘤性狀是單基因Tu(Tuberculate fruit gene)控制的顯性性狀。根據(jù)以前對Tu基因初步定位研究結果和已經(jīng)公開的黃瓜基因組序列，本研究開發(fā)了332個SSR標記和20個SNP標記用于Tu基因的精細定位。使用2808株F2(S06×S52)大群體，利用圖位克隆技術將Tu基因定位于第五染色體物理距離41.6 kb區(qū)間內，該候選區(qū)域含有兩個候選基因，分別是編碼磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因Csa016922和C2H2鋅

3、指蛋白基因Csa016861∶Csa016922序列在兩親本S52(有果瘤)和S06(無果瘤)之間沒有任何差異，呈現(xiàn)出100％序列同源性;而Csa016861基因序列在兩親本S52和S06呈現(xiàn)很大差異，S06共缺失4888 bp片段，即S06完全缺失Csa016861，包括其啟動子和CDS區(qū)。在Csa016861基因的啟動子和CDS區(qū)域分別設計顯性標記TY-1和TY-2，檢測94個來自于世界各地的黃瓜品種，發(fā)現(xiàn)在38個有果瘤品種均存在C

4、sa016861，同時56個無果瘤品種均缺失Csa016861，初步認為Csa016861是Tu的候選基因。另外，開發(fā)的兩個顯性標記TY-1和TY-2均可用于黃瓜果瘤性狀的分子標記輔助選擇育種。
　　使用S06品種半脫殼的3082個子葉節(jié)作為外植體和構建好的過量表達載體pBI121-35S-Tu，通過農(nóng)桿菌GV3101浸染法，進行黃瓜遺傳轉化實驗。陽性轉化苗果實呈現(xiàn)出果瘤性狀表型互補的現(xiàn)象，驗證了Csa016861就是Tu基因，控

5、制果瘤性狀。Tu基因僅含有一個外顯子，CDS區(qū)編碼的213個氨基酸序列中含有植物C2H2型鋅指蛋白特有的高度保守的一段氨基酸序列QALGGH，因此，Tu是編碼C2H2型鋅指蛋白的基因。Southern雜交實驗顯示，Tu基因在黃瓜基因組中以單拷貝形式存在。瞬時轉化煙草實驗結果表明，Tu主要定位于細胞核中，符合轉錄因子特征。通過定量RT-PCR，半定量RT-PCR及mRNA原位雜交，發(fā)現(xiàn)在果瘤發(fā)育過程中，Tu基因在果瘤上面的刺部位特異性表達

6、。在無毛無瘤突變體gl中，盡管存在Tu，但Tu基因并不能表達，說明無毛基因gl對Tu起到隱性上位的作用。這些研究結果同時也說明果刺（毛）是黃瓜果瘤形成的前提條件。本研究可以解釋黃瓜果實有果瘤肯定有刺，有刺不一定有瘤，無刺肯定無瘤的現(xiàn)象。
　　通過對黃瓜果實不同部位細胞分裂素(CTK)的含量比較分析，確定果瘤性狀的形成與CTK高含量有關，CTK加快細胞分裂而導致細胞數(shù)目增多的結果。本研究分析了開花前2天(果瘤起始時期)S06轉基因植

7、株果實刺瘤部位和S06果實表皮的基因表達譜，發(fā)現(xiàn)Tu基因很可能調控CTK通路(No.ko00908)上的兩個上游CTK-羥化酶基因Csa5M644580和Csa5M224130，因此Tu基因很可能調控CTK的合成。另外，甜瓜的Tu同源基因(No: MELO3C005347)在甜瓜果實中不能表達，導致無瘤甜瓜的形成，為Tu基因能夠調控黃瓜果瘤性狀提供了更多的證據(jù)。本研究還分析了Tu基因的進化特點，發(fā)現(xiàn)黃瓜Tu基因很可能是擬南芥ZFP6的直

8、系同源基因。最后，本研究提出了黃瓜果實刺瘤性狀形成的遺傳網(wǎng)絡機制。
　　果實光澤性狀也是黃瓜非常重要的外觀性狀之一，影響著黃瓜的市場價值。通過對光澤性狀的多個群體的遺傳分析表明，黃瓜無光澤性狀為單基因D(dull fruit skin gene)控制的顯性性狀。本研究通過檢測第五染色體的66個已經(jīng)發(fā)表的分子標記，發(fā)現(xiàn)有46個分子標記在定位親本S94（無光澤）和S06(有光澤)間呈現(xiàn)多態(tài)性。進一步通過群體分離法分析法(BSA)，發(fā)現(xiàn)

9、11個標記與D/d基因緊密連鎖。使用216株F2(S06×S94)分離群體，將D/d基因初步定位于SCZ69標記和SSR16203標記之間，遺傳距離分別為0.3 cM和0.6 cM，這兩個標記之間物理距離為422.8 kb。
　　根據(jù)這422.8 kb候選序列，總共開發(fā)了155個SSR標記，其中8個SSR標記在S94和S06間呈現(xiàn)出多態(tài)性。使用842株F2(S06×S94)分離大群體，將標記獲得的分離數(shù)據(jù)與田間性狀數(shù)據(jù)整合，構建了

10、D/d基因的精細定位圖譜，D/d被定位于新開發(fā)的SSR標記SSR37和SSR112之間，物理距離為244.9 kb，該區(qū)間含有31個候選基因。通過半定量RT-PCR分析，確定D候選基因為Csa016880、Csa016887或 Csa016899。與D/d位點緊密連鎖的2個共顯性標記SSR37和SSR112，對72個黃瓜品種進行檢測，結果表明SSR37和SSR112這兩個標記均可用于黃瓜果實光澤性狀的分子標記輔助選擇育種。本研究為D/d