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文檔簡(jiǎn)介
1、白菜型油菜(Brassica rapa L,2n=20, AA)為十字花科蕓薹屬作物,屬于栽培油菜基本種。我國(guó)是白菜和白菜型油菜的起源中心,與甘藍(lán)型油菜相比,其起源和栽培歷史悠久,遺傳資源豐富,具有天然而穩(wěn)定的黃籽資源。目前,已有大量研究表明,與普通黑褐籽油菜相比,黃籽油菜具有油質(zhì)清澈、脂肪和蛋白質(zhì)含量高、皮殼率低、餅粕飼用價(jià)值高、且單寧等有毒物質(zhì)含量低的優(yōu)點(diǎn)。因此,黃籽作為優(yōu)良油菜品種的一種重要的指示性狀受到人們的重視,黃籽油菜品種的
2、選育一直是重要的育種目標(biāo)。本研究通過全基因組重測(cè)序結(jié)合遺傳連鎖圖譜對(duì)白菜型黃籽油菜大黃的粒色基因進(jìn)行了精細(xì)定位,并對(duì)粒色候選基因進(jìn)行克隆及功能分析,初步鑒定了控制大黃粒色的目標(biāo)基因。此外,研究了黃褐籽種子形成過程中種皮色澤的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律及類黃酮代謝中目標(biāo)基因及其他相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子與結(jié)構(gòu)基因的差異表達(dá)。揭示了白菜型油菜種皮中色素在種子發(fā)育時(shí)期的積累規(guī)律,為候選基因與類黃酮途徑其他各基因的調(diào)控機(jī)理提供初步線索。主要研究結(jié)果如下:
1.
3、精細(xì)定位大黃油菜粒色基因,在前人對(duì)大黃油菜粒色基因定位的基礎(chǔ)上,通過新開發(fā)得到的8個(gè)特異性SSR分子標(biāo)記及實(shí)驗(yàn)室已開發(fā)7個(gè)特異性標(biāo)記,進(jìn)一步加密遺傳連鎖圖譜,并得到整合后的物理圖譜,將目標(biāo)基因鎖定在A9染色體上一段1.08Mb(A9:18.26Mb-19.34Mb)區(qū)間。
通過全基因組重測(cè)序定位大黃油菜粒色基因,結(jié)果顯示三個(gè)候選區(qū)段位于A9染色體上(17.83 Mb-18.93 Mb;20.53 Mb-20.99 Mb;22.
4、57 Mb-26.09 Mb)。其中,重測(cè)序定位所得候選區(qū)段之一(17.83 Mb-18.93 Mb)與遺傳連鎖圖譜定位結(jié)果存在大段重疊(overlap),并且該重疊區(qū)段內(nèi)包含5個(gè)與目標(biāo)基因共分離的連鎖標(biāo)記。結(jié)合分子標(biāo)記構(gòu)建遺傳連鎖圖譜的方法和全基因組重測(cè)序的定位方法將目標(biāo)基因所在區(qū)間縮短為678 Kb(A9:18.26 Mb-18.93 Mb)。
2.大黃油菜粒色候選基因Brtt1的克隆及序列分析,在BRAD數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索發(fā)現(xiàn)
5、候選區(qū)間(A9:678Kb)共包含46個(gè)候選基因。通過與擬南芥全基因組序列的同源比對(duì),并參考這46個(gè)候選基因同源基因的功能注釋,分析發(fā)現(xiàn)該區(qū)段僅包含一個(gè)與色素合成相關(guān)的候選基因 BrTT1(Bra028067),其擬南芥同源基因?yàn)楣δ芤阎念慄S酮途徑關(guān)鍵基因 TT1(At1g34790)。且在擬南芥中 TT1基因突變體表現(xiàn)為透明種皮的性狀,推測(cè)BrTT1基因?yàn)榇簏S油菜粒色基因的關(guān)鍵候選基因。
利用白菜基因組序列,擴(kuò)增獲得BrT
6、T1全長(zhǎng)序列4586bp,其中包含啟動(dòng)子片段1796bp,終止子下游序列986bp,編碼區(qū)序列1804bp,該基因包含有2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子。與白菜基因組序列BrTT1參考序列不同的是,該序列在起始密碼子上游39bp處提前編碼,導(dǎo)致白菜型油菜褐籽中BrTT1序列的第一外顯子比參考序列多39堿基,但未引起移碼突變。
等位基因序列分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃籽Brtt1與褐籽BrTT1的啟動(dòng)子序列完全一致,與褐籽序列相比,黃籽材料中Brtt
7、1在外顯子區(qū)存在7處堿基替換,內(nèi)含子區(qū)存在13處SNP位點(diǎn),且存在2bp、9bp、114bp片段缺失。進(jìn)一步進(jìn)行氨基酸序列分析,發(fā)現(xiàn)大黃材料Brtt1編碼蛋白序列有4處氨基酸同義突變,有3處氨基酸有義突變,分別為 N45H、S294Y、H299L。
將BrTT1基因編碼氨基酸序列提交至ExPASy數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.expasy.org)進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè),結(jié)果顯示BrTT1編碼WIP鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子蛋白,其分子式為C
8、145C148H161H165,屬于C2H2類型鋅指蛋白。
3.大黃油菜粒色候選基因BrTT1的遺傳轉(zhuǎn)化,利用花絮浸染農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法,將BrTT1基因全長(zhǎng)轉(zhuǎn)入擬南芥tt1突變體CS82中,共得到20株T1代陽性苗,粒色完全恢復(fù)為野生型種皮顏色褐色,且恢復(fù)率為100%。將 T1代陽性苗轉(zhuǎn)化株繼代至 T3代苗,粒色性狀表現(xiàn)穩(wěn)定。BrTT1基因能夠完全恢復(fù) tt1突變體粒色性狀,使其表現(xiàn)為野生型粒色性狀。BrTT1基因與擬
9、南芥同源基因TT1有相似的基因功能,參與類黃酮代謝途徑。
分別擴(kuò)增黃褐籽 BrTT1全長(zhǎng) ORF序列,構(gòu)建超量表達(dá)載體 p35S::TT1與p35S::tt1,采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花絮浸染的方法分別轉(zhuǎn)化擬南芥tt1突變體CS82。載體p35S::TT1所得31株T1代陽性苗,且種子粒色完全恢復(fù)至野生型種子粒色,載體p35S::tt1所得39株T1代陽性苗,種子粒色與突變體CS82粒色相近,仍為亮黃色。
構(gòu)建 BrTT1亞
10、細(xì)胞定位載體,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草葉片下表皮細(xì)胞和洋蔥內(nèi)皮層細(xì)胞轉(zhuǎn)化法,瞬時(shí)表達(dá)BrTT1:GFP融合蛋白,將BrTT1定位于細(xì)胞核中,這符合轉(zhuǎn)錄因子的特征。
4.黃褐籽不同發(fā)育時(shí)期種皮中色素積累規(guī)律與候選基因BrTT1及類黃酮代謝相關(guān)基因的差異表達(dá),通過體視鏡觀察并比較黃褐籽材料種子形成過程中種皮色澤變化,種子發(fā)育中期(授粉后28天、35天)黃褐籽材料的粒色性狀差異較大,褐籽材料種皮色澤明顯變?yōu)楹稚?,而黃籽材料在整個(gè)種子發(fā)育
11、過程并未存在粒色性狀的較大變化,表現(xiàn)為透明種皮,呈現(xiàn)種胚的顏色。
通過qRT-PCR分析可知,候選基因BrTT1的主要表達(dá)部位在種子形成時(shí)期,且種子形成前期和中期(授粉后7天、14天、21天、28天、35天)黃褐籽材料中BrTT1的表達(dá)量達(dá)到極顯著差異,褐籽表達(dá)量顯著高于黃籽。在授粉后21天褐籽材料中BrTT1的表達(dá)量達(dá)到最高峰值,但在種子形成后期(授粉后49天) BrTT1在黃褐籽材料中的表達(dá)量并未達(dá)到極顯著差異。
12、 對(duì)大黃油菜粒色性狀候選基因BrTT1及類黃酮代謝途徑其他相關(guān)的8個(gè)結(jié)構(gòu)基因和6個(gè)轉(zhuǎn)錄因子在黃褐籽種子形成不同時(shí)期材料中的表達(dá)量進(jìn)行熱圖分析和表達(dá)譜分析,BrTT3、BrTT18、BrBAN在黃褐籽材料中表達(dá)差異較大,且褐籽材料中檢測(cè)到這些基因的大量表達(dá),而在黃籽材料中幾乎不表達(dá)。結(jié)合已有對(duì)其他植物中 TT1的研究結(jié)果,初步推斷白菜型油菜種皮中類黃酮代謝相關(guān)基因的差異表達(dá)可能是導(dǎo)致黃褐籽種皮粒色差異的根本原因。粒色性狀候選基因BrTT1
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