擬南芥葉綠素?zé)晒馑p基因定位克隆與功能初探.pdf

1、植物的衰老是被植物內(nèi)部諸多因素所控制，并與所受外部因素影響相結(jié)合的一種漸行性衰退過(guò)程。衰老機(jī)制的探索，可以提高景觀植物的觀賞價(jià)值和作物的產(chǎn)量品質(zhì)，對(duì)保護(hù)瀕危物種和有文物價(jià)值的名木古樹(shù)也有一定的作用，所以說(shuō)，衰老機(jī)制的研究，不僅具有重要的發(fā)育生物學(xué)意義，而且具有一定的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。葉是主要的光合器官，積累有大量的營(yíng)養(yǎng)，對(duì)光合階段積累的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)選擇再利用，對(duì)植物的健康至關(guān)重要。衰老葉片的細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變中顯著特點(diǎn)就是細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的瓦解，最早的

2、結(jié)構(gòu)變化是葉綠體中基粒結(jié)構(gòu)及含量的改變。葉綠素?zé)晒馐侨~綠素分子從激發(fā)態(tài)變回基態(tài)過(guò)程中釋放的熒光。葉綠體中基粒結(jié)構(gòu)和含量的改變或者任何光合作用的異常，都會(huì)造成葉綠素?zé)晒鈪?shù)的改變。由于衰老葉片中最早的結(jié)構(gòu)改變出現(xiàn)在基粒，所以，以葉綠素?zé)晒鈪?shù)為指標(biāo)，可以篩選潛在的衰老相關(guān)突變體。
　　本研究通過(guò)EMS化學(xué)誘變擬南芥Col-0的野生型，構(gòu)建足夠量的突變體庫(kù)，將突變體正常培養(yǎng)，在萌發(fā)10 d和25 d的時(shí)候，通過(guò)葉綠素?zé)晒饪焖俪上裣到y(tǒng)對(duì)

3、突變體進(jìn)行檢測(cè)，篩選得到葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm有異常的突變體。本實(shí)驗(yàn)以其中一株葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm衰減且可以穩(wěn)定遺傳的突變體E61為實(shí)驗(yàn)材料，經(jīng)兩輪的“回交--自交--篩選”，獲得背景純凈的突變體 E61，后續(xù)遺傳分析確定E61突變體為單基因隱形突變，運(yùn)用定位克隆技術(shù)定位該突變基因在一號(hào)染色體下游SSLP分子標(biāo)記T9L24附近，通過(guò)DNA測(cè)序得到了該突變基因?yàn)锳T1G73470，該基因的413位堿基由G誘變?yōu)锳，編碼的氨基酸由精氨

4、酸(CGC)變?yōu)榱私M氨酸(CAC)。成功克隆該突變基因以后，構(gòu)建該基因的回補(bǔ)、超表達(dá)、組織定位及亞細(xì)胞定位載體，通過(guò)農(nóng)桿菌花序浸染獲得相應(yīng)的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株。經(jīng)過(guò)回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)突變體的葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm衰減的表型，確實(shí)是由AT1G73470基因的突變?cè)斐傻?。通過(guò)GUS染料對(duì)材料進(jìn)行組織定位，結(jié)果表明，該基因在擬南芥生長(zhǎng)期的葉片中進(jìn)行表達(dá)，在根、花以及衰老的葉片中均無(wú)表達(dá)。構(gòu)建的目的基因與GFP融合表達(dá)載體，通過(guò)瞬轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)入擬

5、南芥葉肉細(xì)胞的原生質(zhì)體中，通過(guò)激光共聚焦電子顯微鏡觀察，可見(jiàn)目的蛋白和GFP的融合蛋白以散點(diǎn)狀均勻分布在葉肉細(xì)胞內(nèi)；用線粒體黃色熒光染料對(duì)上述原生質(zhì)體進(jìn)行染色，發(fā)現(xiàn)目的基因的綠色熒光與線粒體的黃色熒光并未重合，該基因并非在線粒體上表達(dá)，具體的亞細(xì)胞定位還需進(jìn)一步確定。在生理生化方面，發(fā)現(xiàn)E61種子的萌發(fā)對(duì)ABA具有一定的耐受性，E61的長(zhǎng)勢(shì)較WT緩慢，花期、衰老都遲于WT，生長(zhǎng)周期長(zhǎng)于WT；E61的葉綠素含量高于WT，可溶性糖略低于WT