MSCs移植對(duì)擴(kuò)張型心肌病TGF-β1、AT1、CYP11B2及心肌膠原表達(dá)影響的研究.pdf

1、目的:探討經(jīng)外周靜脈途徑移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)治療擴(kuò)張型心肌病(dilated cardiomyopathy，DCM)心衰的可行性及對(duì)TGF-β1、AT1、CYP11B2及心肌膠原表達(dá)的影響。
　　 方法:1.擴(kuò)張型心肌病心衰動(dòng)物模型的構(gòu)建與鑒定選取體質(zhì)量為240～290g的8周齡、SPF級(jí)近交系雄性SD大鼠85只，分為2組:DCM組(n=65)、正常對(duì)照組(n=20)。D

2、CM組采用腹腔注射多柔比星（adriamycin，ADR，阿霉素）的方法(每次2.5mg/kg，1次/周，共6周，累積劑量15mg/kg)構(gòu)建DCM心衰模型;正常對(duì)照組以等容積的生理鹽水代替ADR進(jìn)行腹腔注射。給藥第10周對(duì)兩組大鼠行心臟超聲檢查，觀察左室舒張末期內(nèi)徑、左室收縮末期內(nèi)徑、左室射血分?jǐn)?shù)、左室短軸縮短率。給藥第10周末每組大鼠任取10只處死后，行心肌組織HE、Masson病理染色、心肌膠原分析及免疫組化檢測(cè)心肌組織Ⅰ、Ⅲ型膠

3、原表達(dá)。2.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療擴(kuò)張型心肌病將DCM組大鼠分為細(xì)胞移植組(n=15)、移植對(duì)照組(n=16)、DCM空白組(n=16)。細(xì)胞移植組經(jīng)尾靜脈注射含MSCs的細(xì)胞懸液，每次細(xì)胞數(shù)量5×106/只，注射容積為0.5ml，共移植10次，隔日一次;移植對(duì)照組予以不含MSCs的無血清培養(yǎng)基注射，注射容積與方法同細(xì)胞移植組;DCM空白組不予任何干預(yù)。正常對(duì)照組(n=10)亦不予任何干預(yù)。四組大鼠均置于同等條件下飼養(yǎng)。于細(xì)胞移植前、

4、末次移植后第5周及第20周分別進(jìn)行心臟超聲檢查，觀察左室舒張末期內(nèi)徑、左室收縮末期內(nèi)徑、左室射血分?jǐn)?shù)、左室短軸縮短率。于末次移植后第20周末將四組大鼠全部處死后，行心肌組織HE、Masson病理染色、心肌膠原分析及免疫組化檢測(cè)心肌組織Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)，RT-PCR擴(kuò)增Ⅰ、Ⅲ膠原、TGF-β1、AT1、CYP11B2基因片段，檢測(cè)其mRNA的表達(dá)。數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 結(jié)果:1.擴(kuò)張型心肌病心衰動(dòng)物模型的構(gòu)建與鑒定經(jīng)ADR腹

5、腔注射后，DCM組大鼠逐漸出現(xiàn)不同程度的腹水、活動(dòng)量減少、進(jìn)食量下降等心衰表現(xiàn)。心臟超聲檢查顯示DCM組大鼠心腔擴(kuò)大，左室舒張末期內(nèi)徑、左室收縮末期內(nèi)徑分別大于正常對(duì)照組[(7.5±0.3)mm vs.(5.5±0.2)mm，(4.7±0.1)mm vs.(2.6±0.2)mm，P＜0.05]，而左室射血分?jǐn)?shù)、左室短軸縮短率分別低于正常對(duì)照組[(65.4±1.3)％ vs.(87.2±0.6)％，(30.1±0.7)％ vs.(50.8

6、±0.7)％，P＜0.05]。DCM組大鼠心肌組織HE染色顯示心肌纖維排列紊亂，部分心肌纖維正常結(jié)構(gòu)消失，細(xì)胞核深染，可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn);心肌組織Masson染色可見大量藍(lán)染的膠原纖維，與染成紅色的心肌纖維交錯(cuò)排列。心肌膠原分析顯示DCM組大鼠心肌膠原容積分?jǐn)?shù)為(29.16±1.07)％，明顯高于正常對(duì)照組(3.12±0.43)％，兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。免疫組化檢測(cè)顯示DCM組大鼠心肌細(xì)胞間質(zhì)中可見大量棕褐色的Ⅰ、Ⅲ型

7、膠原表達(dá);DCM組心肌Ⅰ/Ⅲ型膠原比值(1.33±0.02)大于正常對(duì)照組(1.12±0.03)，兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05)。2.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療擴(kuò)張型心肌病細(xì)胞移植組大鼠通過靜脈注射MSCs后，一般情況好轉(zhuǎn)，紫紺、活動(dòng)量減少、進(jìn)食量下降等心衰表現(xiàn)明顯改善。末次移植后第20周心臟超聲檢查顯示:細(xì)胞移植組左室舒張末期內(nèi)徑、左室收縮末期內(nèi)徑[(6.4±0.2) mm，(3.6±0.1)mm]明顯低于移植對(duì)照組[(7.0

8、±0.4)mm，(6.0±0.2)mm]和DCM空白組[(7.0±0.3) mm，(5.0±0.3)mm](P＜0.05)，而LVEF、LVFS[(79.±0.3)％，(40.3±1.6)％]明顯高于移植對(duì)照手術(shù)組[(65.8±0.6)％，(30.4±0.1)％]和DCM空白組[(67.1±0.8)％，(30.3±0.2)％]（P＜0.05）。心肌組織HE染色顯示:細(xì)胞移植組心肌纖維的形態(tài)結(jié)構(gòu)較移植對(duì)照組和DCM空白組明顯改善，其中可見

9、移植細(xì)胞存活，其細(xì)胞核濃染，核漿比例較正常心肌細(xì)胞大。心肌組織Masson染色顯示:與移植對(duì)照組和DCM空白組相比，細(xì)胞移植組藍(lán)染的膠原纖維明顯減少，代之以染成紅色的心肌纖維。心肌膠原分析顯示細(xì)胞移植組大鼠心肌膠原容積分?jǐn)?shù)為(16.74±0.92)％，明顯低于移植對(duì)照組(28.73±1.22)％和DCM空白組(28.77±1.19)％，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。免疫組化檢測(cè)顯示細(xì)胞移植組大鼠心肌間質(zhì)內(nèi)增生的Ⅰ、Ⅲ型膠原較移植對(duì)

10、照組和DCM空白組明顯減少;細(xì)胞移植組心肌Ⅰ/Ⅲ型膠原比值(1.24±0.02)小于移植對(duì)照組(1.36±0.02)和DCM空白組(1.36±0.02)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。RT-PCR檢測(cè)顯示Ⅰ型膠原:正常對(duì)照組、DCM空白組、移植對(duì)照組、細(xì)胞移植組產(chǎn)物灰度值分別為(0.178±0.014)、(0.362±0.024)、(0.370±0.016)、(0.304±0.017)，細(xì)胞移植組產(chǎn)物灰度值較DCM空白組、移植對(duì)照

11、組高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），均高于正常對(duì)照組（P＜0.05）。Ⅲ型膠原各組產(chǎn)物灰度比分別為(0.636±0.014)、(0.792±0.027)、(0.804±0.022)、(0.928±0.015)，細(xì)胞移植組產(chǎn)物灰度值較DCM空白組、移植對(duì)照組高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），以上三組產(chǎn)物灰度值均高于正常對(duì)照組（P＜0.05）。TGF-β1各組產(chǎn)物灰度比分別為(0.443±0.021)、(0.805±0.020)

12、、(0.812±0.013)、(0.628±0.016)，細(xì)胞移植組產(chǎn)物灰度值較DCM空白組、移植對(duì)照組低（P＜0.05），以上三組產(chǎn)物灰度值均高于正常對(duì)照組（P＜0.05）。AT1各組產(chǎn)物灰度比分別為(0.426±0.018)、(0.801±0.021)、(0.821±0.027)、(0.558±0.038)，細(xì)胞移植組產(chǎn)物灰度值較DCM空白組、移植對(duì)照組低（P＜0.05），以上三組產(chǎn)物灰度值均高于正常對(duì)照組（P＜0.05）。CYP1

13、1B2各組產(chǎn)物灰度比分別為(0.274±0.015)、(0.616±0.011)、(0.617±0.013)、(0.509±0.028)，細(xì)胞移植組產(chǎn)物灰度值較DCM空白組、移植對(duì)照組低（P＜0.05），以上三組產(chǎn)物灰度值均高于正常對(duì)照組（P＜0.05）。Ⅰ/Ⅲ型膠原灰度比分別為(0.263±0.016)、(0.458±0.026)、(0.461±0.018)、(0.328±0.025)，細(xì)胞移植組產(chǎn)物灰度值較DCM空白組、移植對(duì)照組低

14、（P＜0.05），以上三組產(chǎn)物灰度值均高于正常對(duì)照組（P＜0.05）。
　　 結(jié)論:1.通過ADR分次小劑量腹腔注射的方法可成功建立與臨床上DCM病理及病理生理過程高度一致的經(jīng)典DCM心衰動(dòng)物模型，為該病的研究提供了經(jīng)濟(jì)、可靠的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，并為下一步?shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行提供了基礎(chǔ)。2.在ADR誘導(dǎo)的DCM心衰大鼠模型中，通過外周靜脈注射途徑多次移植體外培養(yǎng)、擴(kuò)增的MSCs，使大鼠心衰癥狀減輕，心功能得以一定程度的改善。3.MSCs移植治