環(huán)境優(yōu)化技術(shù)在組織工程化軟骨研究過程中的應(yīng)用.pdf

1、本文研究目的：從“環(huán)境模擬”和“環(huán)境優(yōu)化”的角度，探討種子細胞表型穩(wěn)定的體外最佳生長環(huán)境。課題包括三個部分：環(huán)境分析、環(huán)境模擬、環(huán)境優(yōu)化。重點分析細胞因子、血清濃度等環(huán)境組分對種子細胞的影響，通過研制的內(nèi)環(huán)境模擬器，模擬關(guān)節(jié)腔內(nèi)環(huán)境，借助均勻分析的統(tǒng)計分析方法，篩選有利于種子細胞表型穩(wěn)定的最佳生長環(huán)境。 研究方法： 一、環(huán)境分析(environmentanalyses，EA)： 1、hBMSC在不同的BMP-2水

2、平和血清濃度下向軟骨細胞分化：以人骨髓基質(zhì)干細胞作為種子細胞，將不同的BMP-2和血清濃度進行組合，觀察種子細胞在這些組合條件下的生長情況，通過檢測甲苯胺藍、堿性磷酸酶、總蛋白、MTT、Ⅱ型膠原mRNA，考察不同BMP-2和血清濃度下hBMSC成軟骨的能力。 2、轉(zhuǎn)染BIG-3的hBMSC向軟骨細胞誘導分化研究：以轉(zhuǎn)染BIG-3基因的人骨髓基質(zhì)干細胞作為種子細胞，考察其在不同的BMP-2和血清濃度組合下成軟骨的能力。比較hBMS

3、C-BIG-3和hBMSC在各自最佳成軟骨條件下成軟骨能力的差異，從而考察該基因的生理作用，推測血清在影響B(tài)MP-2生理活性過程中可能的作用環(huán)節(jié)。檢測指標包括甲苯胺藍染色、Ⅱ型膠原mRNA染色。 3、hBMSC和hBMSC-BIG-3分別在BMP-2與TGF-β1誘導下向軟骨細胞分化：首先考察不同的的TGF-β1濃度下，hBMSC成軟骨能力，以尋求最佳的TGF-β1濃度。再考察BMP-2與TGF-β1在各自最佳濃度情況下，對應(yīng)的

4、最佳種子細胞成軟骨的能力，檢測指標包括甲苯胺藍染色，Ⅱ型膠原mRNA染色。 二、環(huán)境模擬(environmentsimulation，ES)： 1、一種簡便實用的關(guān)節(jié)腔內(nèi)環(huán)境模擬器：研發(fā)一種能夠模擬靜態(tài)壓力、氧氣濃度的內(nèi)環(huán)境模擬器，并進行壓力穩(wěn)定性、氧氣濃度穩(wěn)定性及細胞生長情況測試。 三、環(huán)境優(yōu)化(environmentoptimization，EO)： 1、TGF-β1誘導hBMSC向軟骨細胞分化的環(huán)境

5、優(yōu)化研究：在內(nèi)環(huán)境模擬器內(nèi)，模擬靜態(tài)壓力、氧氣、血清、TGF-β1、透明質(zhì)酸五因素，比較不同組合水平下hBMSC軟骨細胞分化的能力，借助均勻分析的統(tǒng)計方法，優(yōu)化這些因素的最佳作用濃度，尋找hBMSC最好的體外生長環(huán)境。檢測指標包括甲苯胺藍染色，S-100免疫組化染色，Ⅱ型膠原mRNA染色。 研究結(jié)果：hBMSC可以作為試驗用種子細胞，BMP-2可以促進其向軟骨轉(zhuǎn)化，不同的血清和BMP-2濃度，分化效果不同，以2％FBS+400n

6、g/mlBMP-2組合最佳。轉(zhuǎn)染BIG-3基因后，hBMSC最佳分化條件發(fā)生了變換，以5％FBS+400ng/mlBMP-2組合最佳，且轉(zhuǎn)化能力較未轉(zhuǎn)染前明顯提高。TGF-β1較BMP-2而言，其促進hBMSC分化為軟骨的能力更強。在氧氣濃度為9％和TGF-β1濃度為8ng/ml水平下，當靜態(tài)壓力為-40mmHg，血清濃度為2.55％，透明質(zhì)酸為0ng/ml時，Ⅱ型膠原mRNA產(chǎn)生量最多。 研究結(jié)論：hBMSC可以作為組織工程化