乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌中miRNA的表達(dá)譜分析及miRNA-132功能研究.pdf

1、目的：
　　 腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多基因參與、經(jīng)多階段、多步驟漸進(jìn)演化的復(fù)雜過(guò)程。該過(guò)程涉及到眾多原癌基因的激活和腫瘤抑制基因的突變和/或失活。最近研究發(fā)現(xiàn)，microRNA(miRNA)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中有著不可或缺的重要作用，常發(fā)揮致癌因子或抑癌因子的作用，可以解釋腫瘤的發(fā)病機(jī)制和提供新的腫瘤治療策略，現(xiàn)已成為腫瘤分子方向研究的熱點(diǎn)。乳腺癌是一種異質(zhì)性非常高的惡性腫瘤，不同miRNA在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中扮演不同角色，即使同一

2、miRNA在乳腺癌不同階段可能發(fā)生不同的表達(dá)變化。迄今為止，有關(guān)miRNA在乳腺癌癌前病變中表達(dá)水平改變的研究甚少。在我們的研究中，通過(guò)miRNA芯片和實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)系統(tǒng)研究miRNA在乳腺癌癌前病變(導(dǎo)管內(nèi)癌，DuctalCarcinomainsitu，DCIS)中表達(dá)水平的改變。并且希望找到在乳腺癌早期發(fā)揮特定作用的miRNA，進(jìn)而對(duì)這些新發(fā)現(xiàn)的miRNA進(jìn)行功能學(xué)研究，探討這些miRNA在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中扮演的角色，以期為乳腺

3、癌的早期發(fā)現(xiàn)提供有效的腫瘤標(biāo)志物，并且為今后的乳腺癌的治療研究方向提供線索。
　　 方法：
　　 選取天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院2007-2012年間經(jīng)乳腺外科手術(shù)所得的21對(duì)凍存乳腺組織，每一對(duì)包含來(lái)自同一患者的DCIS組織及相應(yīng)乳腺癌旁正常組織（Adjacentnormaltissues，NATs），從中選取1對(duì)凍存組織進(jìn)行miRNA芯片分析，根據(jù)芯片檢測(cè)結(jié)果篩選出兩種組織中表達(dá)差異的miRNA，利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)

4、在21對(duì)凍存組織中進(jìn)行驗(yàn)證。然后從所有驗(yàn)證結(jié)果中選出在DCIS腫瘤組織中表達(dá)水平發(fā)生明顯改變的miRNA-132進(jìn)行體外功能學(xué)研究。利用MDA-MB-231、MCF-7和BT-549三種乳腺癌細(xì)胞系，通過(guò)CCK-8試劑、克隆形成實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)對(duì)miRNA-132在乳腺癌細(xì)胞分裂增殖過(guò)程中扮演的角色進(jìn)行系統(tǒng)的功能學(xué)研究。
　　 結(jié)果：
　　 1.通過(guò)miRNA芯片對(duì)樣本進(jìn)行檢測(cè)，與相應(yīng)NATs相比，檢測(cè)出在852個(gè)miR

5、NA在兩種組織中存在表達(dá)水平差異，但以差異倍數(shù)FC(FoldChange)≥3做為表達(dá)差異篩選標(biāo)準(zhǔn)，僅有155個(gè)miRNA表達(dá)差異符合我們的篩選標(biāo)準(zhǔn)，并且通過(guò)這些差異表達(dá)的miRNA我們可以明顯區(qū)分兩種組織。
　　 2.在miRNA芯片基礎(chǔ)上，我們從中選取表達(dá)水平發(fā)生較大改變的miRNA，利用實(shí)時(shí)定量PCR方法在21對(duì)組織中分別進(jìn)行驗(yàn)證，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示miRNA-125b、miRNA-145、miRNA-10b、miRNA-132

6、、miRNA-409、miRNA-154和miRNA-382表達(dá)水平發(fā)生的改變具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 3.miRNA-132進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)功能學(xué)驗(yàn)證，在CCK-8實(shí)驗(yàn)中顯示其在MDA-MB-231、MCF-7和BT-549細(xì)胞中具有抑制乳腺癌細(xì)胞增殖的作用;細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示其在MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞中具有抑制乳腺癌細(xì)胞克隆的形成的作用;在流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)中顯示其在BT-549細(xì)胞系中可以將細(xì)胞周期阻滯在S/G

7、2的階段。
　　 結(jié)論：
　　 1.通過(guò)miRNA芯片的測(cè)量和實(shí)時(shí)定量PCR的驗(yàn)證工作，證實(shí)在與乳腺癌浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移有關(guān)的miRNA中，miRNA-125b、miRNA-145和miRNA-10b在乳腺癌早期階段(DCIS)表達(dá)水平就已經(jīng)發(fā)生明顯的改變，且三者均發(fā)生低水平表達(dá)改變。
　　 2.通過(guò)miRNA芯片的測(cè)量和實(shí)時(shí)定量PCR的驗(yàn)證工作，證實(shí)既往在乳腺癌領(lǐng)域中研究較少的miRNA-132、miRNA-409、mi