膽管癌發(fā)生相關(guān)miRNA的表達(dá)及功能的初步研究.pdf

1、研究背景：膽管癌(Cholangiocarcinoma)是起源于膽管上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，依據(jù)發(fā)病部位分為肝內(nèi)膽管癌和肝外膽管癌，起病隱匿，進(jìn)展快，早期診斷困難，預(yù)后差，死亡率高。近年來(lái)膽管癌的發(fā)病率逐年增加，己成為威脅人類健康的主要惡性腫瘤之一。因此，探索膽管癌有效的早期診斷及治療至關(guān)重要。MicroRNAs(miRNAs)是一類長(zhǎng)度為20～24個(gè)核苷酸的非編碼RNA分子，具有序列特異性調(diào)節(jié)基因表達(dá)的功能，是轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控的重要分子之一

2、。近年來(lái)其表達(dá)異常與惡性腫瘤的關(guān)系成為腫瘤研究領(lǐng)域的新熱點(diǎn)，可為腫瘤診治提供一種有效的新策略。
　　 研究目的：篩選、鑒定肝內(nèi)及肝外膽管癌組織表達(dá)上調(diào)、下調(diào)的miRNAs，進(jìn)行初步的功能研究：探討miRNA-21在膽管癌組織中的表達(dá)特征及其功能，篩選并鑒定miRNA-21可能調(diào)控的靶基因。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：用miRNA-基因芯片方法篩選肝內(nèi)、肝外膽管癌組織特異表達(dá)上調(diào)、下調(diào)或共同表達(dá)上調(diào)、下調(diào)的miRNA，選擇Real-

3、TimePCR方法進(jìn)行驗(yàn)證；根據(jù)肝內(nèi)及肝外膽管癌不同的上調(diào)、下調(diào)miRNAs表達(dá)譜，選擇差異明顯且具有代表性的miRNAs，用miRNA特異類似物轉(zhuǎn)染膽管癌細(xì)胞系QBC939，應(yīng)用MTT試劑盒分析細(xì)胞增殖變化，研究表達(dá)上調(diào)、下調(diào)miRNAs與膽管癌細(xì)胞增殖的關(guān)系；用Real-Time PCR與Northern Blot法分析miR-21在膽管癌組織及膽管癌細(xì)胞系QBC939中的表達(dá)；選擇特異抑制劑Anti-miR-21敲低QBC939細(xì)

4、胞內(nèi)源性miR-21的表達(dá)，檢測(cè)細(xì)胞增殖及凋亡表型：用雙螢光素酶報(bào)告基因、western blot及流式細(xì)胞儀分析法篩選并鑒定miR-21的靶基因；用體外侵襲實(shí)驗(yàn)分析miR-21對(duì)膽管癌細(xì)胞系QBC939體外侵襲能力的影響。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：肝外膽管癌組織特異表達(dá)上調(diào)的miRNAs有28個(gè)，肝內(nèi)膽管癌有21個(gè)miRNAs特異表達(dá)上調(diào)，在肝內(nèi)及肝外膽管癌組織均表達(dá)下調(diào)的miRNAs共12個(gè)；在膽管癌細(xì)胞系QBC939中抑制miR-

5、125b、miR-19a、miR-21以及miR-378*的內(nèi)源性表達(dá)，可以明顯抑制QBC939細(xì)胞的增殖；肝外膽管癌組織特異表達(dá)下調(diào)的miRNAs共25個(gè)，肝內(nèi)膽管癌組織特異表達(dá)下調(diào)的miRNAs共15個(gè)，在肝內(nèi)及肝外膽管癌組織均表達(dá)下調(diào)的miRNAs共6個(gè)；在膽管癌細(xì)胞系QBC939中過(guò)表達(dá)miR-181a，miR-596、miR-492以及miR-602可以明顯抑制細(xì)胞增殖；miR-21在膽管癌組織及膽管癌細(xì)胞系QBC939中表達(dá)

6、均明顯上調(diào)；QBC939轉(zhuǎn)染Anti-miR-21后，抑制細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡；PTEN、PDCD4、RECK是miR-21在膽管癌細(xì)胞中的靶基因；miR-21可以抑制RECK的表達(dá)，增強(qiáng)了膽管癌細(xì)胞的侵襲能力。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)論：肝內(nèi)及肝外膽管癌具有不同的miRNAs表達(dá)譜，敲低表達(dá)上調(diào)的miRNAs可以明顯抑制膽管癌細(xì)胞增殖；表達(dá)下調(diào)的miRNAs可以明顯抑制膽管癌細(xì)胞增殖；抑制miR-21的表達(dá)水平可以抑制膽管癌的進(jìn)展，提