microRNA-144在膽管癌中的表達及功能機制研究.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 膽管癌中microRNA差異的篩選和驗證
　　目的：在膽管癌腫瘤組織及其癌旁膽管組織中篩選microRNAs的差異表達，為下一步的研究選擇研究對象。
　　方法：采用MicroArray表達譜芯片檢測3對膽管癌及癌旁膽管組織中miRNA的表達差異；根據(jù)芯片的結(jié)果進行GO功能分析和Pathyway通路分析，對膽管癌發(fā)生發(fā)展過程中有關(guān)的miRNAs及相關(guān)信號通路進行預(yù)測；通過實

2、時定量PCR在膽管癌組織和膽管癌細胞系中，對部分miRNA的表達差異進行驗證。
　　結(jié)果：同癌旁膽管組織相比較，膽管癌組織中一共有28條miRNA存在表達差異，其中19條上調(diào)，9條下調(diào)；GO分析和Pathyway分析顯示miR-144在膽管癌的發(fā)生發(fā)展中可能起著重要的作用；miR-144在膽管癌組織和膽管癌細胞系中均表達降低，與芯片檢測的結(jié)果相符合。
　　結(jié)論：膽管癌組織和癌旁膽管組織中miRNAs的表達存在明顯差異。在膽管

3、癌組織和膽管癌細胞系中miR-144的表達均降低，可以作為進一步的研究對象。
　　第二部分 miR-144對膽管癌細胞增殖和侵襲能力的影響
　　目的：體外實驗檢測miR-144對膽管癌細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響；初步探討其可能作用的下游蛋白。
　　方法：利用慢病毒載體PCDH-miR-144轉(zhuǎn)染人膽管癌細胞系，構(gòu)建過表達miR-144的膽管癌細胞系HCCC-9810和CCLP1；通過CCK-8實驗檢測miR-144

4、對膽管癌細胞的增殖的影響；通過劃痕實驗、侵襲實驗檢測其對膽管癌細胞遷移和侵襲能力的影響。Western Blot檢測miR-144對增殖、侵襲相關(guān)蛋白的影響。
　　結(jié)果：過表達miR-144膽管癌細胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建成功；miR-144顯著降低膽管癌細胞系HCCC-9810、CCLP1細胞增殖的能力；miR-144明顯降低膽管癌細胞的遷移和侵襲能力；miR-144降低p-AKT和MMP-2的蛋白表達。
　　結(jié)論：在體外miR-14

5、4可以降低膽管癌細胞的增殖能力，同時減低膽管癌細胞的遷移和侵襲能力；miR-144對膽管癌增殖、遷移能力的影響可能是通過下調(diào)p-AKT和MMP-2表達來實現(xiàn)的。
　　第三部分 miR-144作用靶點的篩選及驗證
　　目的：篩選并驗證miR-144的可能作用靶點，進一步闡明miR-144的生物學功能。
　　方法：通過miRanda、PicTar和Target Scan軟件預(yù)測并驗證可能的靶基因；構(gòu)建雙熒光素酶報告基因，驗

6、證miR-144與靶基因的直接結(jié)合，并明確其結(jié)合位點；利用siRNA干擾沉默LIS1后檢測LIS1對膽管癌細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響，Western Blot驗證LIS1對增殖和侵襲相關(guān)的信號通路的影響，驗證miR-144與LIS1功能學上的一致性。
　　結(jié)果：LIS1是miR-144可能的靶基因之一；miR-144可以通過結(jié)合于LIS1的3’UTR兩個可能的結(jié)合位點調(diào)控LIS1的表達；干擾 LIS1后可以下調(diào)p-AKT和MM

7、P2的水平，從而影響膽管癌細胞的增殖和侵襲；
　　結(jié)論：miR-144通過直接作用于LIS1影響膽管癌細胞的增殖和侵襲能力，這種作用是通過下調(diào)p-AKT和MMP2來實現(xiàn)的。
　　第四部分 miR-144功能的體內(nèi)驗證及其臨床意義
　　目的：體內(nèi)驗證miR-144對膽管癌增殖和轉(zhuǎn)移的抑制作用；在膽管癌臨床樣本中分析miR-144與臨床病理特點之間的關(guān)系，評估m(xù)iR-144的臨床價值。
　　方法：裸鼠皮下移植瘤和膽管

8、癌肝臟轉(zhuǎn)移模型分析miR-144對膽管癌增殖和轉(zhuǎn)移能力的影響；收集2008年3月至2012年9月同濟醫(yī)院住院手術(shù)的53例膽管癌病人的病理資料，RT-PCR檢測miR-144和LIS1的表達，分析二者的相關(guān)性；免疫組化檢測臨床樣本中LIS1、AKT、p-AKT、MMP2的表達；分析miR-144與臨床病理之間的關(guān)系。
　　結(jié)果：miR-144也可以抑制裸鼠膽管癌移植瘤的生長和轉(zhuǎn)移；臨床樣本中miR-144與LIS1的表達呈負相關(guān)；m