CD147與CAML在惡性黑素瘤細(xì)胞中的相互作用研究.pdf

1、研究目的:
　　CD147是一種屬于免疫球蛋白超家族的跨膜糖蛋白，本實(shí)驗(yàn)組前期研究表明CD147能促進(jìn)惡性黑素瘤侵襲、轉(zhuǎn)移、增殖和血管新生，但具體機(jī)制還不十分清楚。鈣離子信號調(diào)節(jié)親環(huán)素配體（calcium-modulatingcyclophilinligand，CAML）是定位于線粒體的跨膜蛋白，能調(diào)節(jié)胞內(nèi)鈣離子濃度，本研究擬通過對CD147與CAML在惡性黑素瘤細(xì)胞株A375中相互作用的研究，明確其相互作用的位點(diǎn)，在細(xì)胞中的定位

2、及對胞內(nèi)鈣離子的影響，為進(jìn)一步揭示惡性黑素瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。
　　研究方法:
　　1.以CD147為誘餌，運(yùn)用酵母雙雜交技術(shù)篩選人胚腦細(xì)胞文庫，以尋求與其相互作用的蛋白。
　　2.構(gòu)建CAML與CD147全長及缺失突變體的真核表達(dá)載體。
　　3.運(yùn)用免疫共沉淀(co-IP)驗(yàn)證CD147與CAML相互結(jié)合，同時(shí)共轉(zhuǎn)染CAML質(zhì)粒及CD147的不同缺失突變體質(zhì)粒至工具細(xì)胞293T，co-IP分析CD

3、147與CAML相互結(jié)合的位點(diǎn)。
　　4.運(yùn)用細(xì)胞免疫熒光方法觀察A375細(xì)胞中CD147與CAML的定位，同時(shí)在A375細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染CAML及CD147的不同缺失突變體質(zhì)粒，檢測不同區(qū)段對定位的影響。
　　5.合成CD147的小分子干擾RNA(smallinterferingRNA，iRNA)片段，利用該片段在A375細(xì)胞中敲降CD147并檢測敲降效率。
　　6.運(yùn)用Fluo-4，AM探針觀察CD147敲降對A375

4、細(xì)胞內(nèi)靜息鈣離子濃度的影響，以及毒胡蘿卜素(thapsigargin，TG)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子ATP酶(Sarco/EndoplasmicreticulumCa2+-ATPase，SERCA)后對胞內(nèi)鈣離子流動(dòng)的影響。
　　7.運(yùn)用佛波酯(phorbol12-myristate13-acetate，PMA)和TG上升A375細(xì)胞胞內(nèi)鈣離子，檢測基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrixmetalloproteinase9，MMP-9)的表達(dá)水平

5、，同時(shí)檢測CD147敲降的A375細(xì)胞在上述兩種藥物作用后的MMP-9表達(dá)水平的變化。
　　研究結(jié)果:
　　1.酵母雙雜交篩選出CAML與CD147相互作用。
　　2.成功構(gòu)建了CAML與CD147全長及缺失突變體的真核表達(dá)載體。
　　3.Co-IP驗(yàn)證CAML與CD147相互作用的結(jié)果，并進(jìn)一步證實(shí)CD147與CAML相互結(jié)合的區(qū)段位于CD147跨膜段。
　　4.細(xì)胞免疫熒光發(fā)現(xiàn)A375細(xì)胞中CD147與

6、CAML在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)存在共定位現(xiàn)象，缺失跨膜及膜內(nèi)段的CD147突變體與CAML幾乎不存在共定位。
　　5.成功設(shè)計(jì)并應(yīng)用兩個(gè)CD147siRNA片段，以無特異性siRNA序列為對照組。
　　6.CD147敲降的A375細(xì)胞內(nèi)靜息鈣離子濃度及TG刺激胞漿內(nèi)鈣離子上升幅度均低于對照組。
　　7.PMA及TG上升胞內(nèi)鈣離子后能誘導(dǎo)MMP-9的表達(dá)增加，而敲降CD147則能顯著抑制鈣離子對MMP-9的誘導(dǎo)效應(yīng)。
　　結(jié)論：