鰱魚卵中高分子CPIs的純化鑒定及其對Ishikawa細胞影響的初探研究.pdf

1、本研究綜合利用各種層析方法從鰱魚Ⅳ期卵中分離純化了兩種高分子CPIs，分別命名為gLMW CPI-a-3-17和gHMW CPI-b-2-14。在純化過程中通過SDS-PAGE和明膠底物-SDS-反相酶譜法對其進行了監(jiān)測和鑒定。通過TSK gel G2000 SWXL凝膠高效液相色譜和Jupiter300 C4反相高效液相，進一步鑒定了它們的純度，進而通過分析兩種高分子CPIs的MALDI-TOF-TOF肽指紋圖譜鑒定蛋白。此外，分析了

2、鰱魚卵高分子CPIs的熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性、抑制常數Ki和抑制活性類型等理化特性和動力學常數指標。最后，通過測定Ishikawa細胞增殖、遷移、粘附、克隆形成率、細胞形態(tài)以及細胞因子VEGF-A分泌情況等指標，初步探討了鰱魚卵高分子CPI gHMW CPI-b-2-14對Ishikawa細胞的影響。
　　鰱魚卵高分子CPIs的純化鑒定:
　　對經勻漿、酸處理和30KDa超濾濃縮的鰱魚卵高分子CPIs粗提液進行層析純化，以靈敏

3、度較高的熒光合成肽底物法檢測層析后CPIs的抑制活性。取Sp SepharoseFast Flow陽離子交換層析中抑制活性和比活均最高的峰Ⅱ，進行Blue Sepharose6Fast Flow染料親和層析，收集主要活性峰3經Octyl-Sepharose4 Fast Flow疏水層析，得活性較高的活性部分a和活性部分b。
　　活性部分a經ConA Sepharose4B親和層析后所得的吸附糖蛋白部分a-3，經TSK gel G2

4、000 SWXL凝膠高效液相鑒定表明，其僅在保留時間為17.331 min呈現蛋白峰，C4反相高效液相分析其在14.321min處存在單一峰，得到了有效的純化，純化了848.76倍，收率為2.13％，并將該部分命名為gLMW CPI-a-3-17。利用SDS-PAGE及TSK gel G2000 SWXL凝膠高效液相標準曲線判斷其分子量為44KDa。
　　活性部分b經ConA Sepharose4B親和層析后得到的不吸附的非糖基化

5、部分b-1和吸附的糖基化部分b-2，兩者再經TSK gel G2000 SWXL凝膠高效液相后分別在保留時間為13.727min、14.421 min處獲得單一蛋白峰，將其命名為ungHMWCPI-b-1-14和gHMW CPI-b-2-14。進一步通過C4反相高效液相分析gHMWCPI-b-2-14在14.544min處存在單一峰。最終糖基化的gHMW CPI-b-2-14純化了468.91倍，收率為2.07％。SDS-PAGE結合明

6、膠底物-SDS-反相酶譜法鑒定gHMWCPI-b-2-14分子量為125KDa。通過蛋白的MALDI-TOF-TOF肽指紋圖譜鑒定，表明ungHMW CPI-b-1-14與青鳉Medaka(Oryzias latipes)的一種未鑒定蛋白匹配，而gHMW CPI-b-2-14未得到鑒定。
　　gLMW CPI-a-3-17和gHMW CPI-b-2-14都具有較寬的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性，在80℃分別保留90％及80％以上的殘余抑制

7、活性，且分別在pH7.0-9.0及pH8.0時最穩(wěn)定，均能有效的抑制Papain、Catehpsin B和Catehpsin L，而對Trypisn和Chymotrypsin不具有抑制活性。利用Dixon-plot作圖法測得gLMW CPI-a-3-17和gHMW CPI-b-2-14都屬于競爭性抑制劑，抑制常數Ki分別為0.0292nM和0.0116nM。
　　鰱魚卵gHMW CPI-b-2-14對Ishikawa細胞的影響:<

8、br>　　對Ishikawa細胞的影響的初探研究表明，鰱魚卵gHMW CPI-b-2-14能有效的抑制Ishikawa細胞的增殖，且呈現劑量和時間相關性，即隨著gHMW CPI-b-2-14劑量的增加和培養(yǎng)時間的延長，抑制作用越大。高劑量組（5-40μg/mL）的gHMWCPI-b-2-14在培養(yǎng)一周后對單克隆的Ishikawa細胞具有致死效應，而低劑量組（0.5-2.5μg/mL）隨著gHMW CPI-b-2-14劑量的增加，Ishi

9、kawa細胞克隆形成能力下降，單個克隆內的細胞數量減少，與對照組相比，各劑量組差異極顯著(p＜0.01)。劃痕實驗結果表明，Ishikawa細胞的遷移能力也與gHMW CPI-b-2-14呈現劑量和時間相關性，培養(yǎng)72h后對照組劃痕處呈現愈合狀態(tài)，而高劑量組(5-40μg/mL)與0h時劃痕寬度差異不顯著(p＞0.05)。且隨著gHMW CPI-b-2-14劑量的增加，對Ishikawa細胞粘附能力抑制效果越顯著。Hoechest333