草食動(dòng)物厭氧真菌與共存甲烷菌的分離鑒定及其代謝產(chǎn)物分析.pdf

1、草食動(dòng)物瘤胃內(nèi)棲息的微生物包括厭氧真菌、古菌、原蟲(chóng)和真細(xì)菌。在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中，這些微生物間形成了相互依存，相互制約的復(fù)雜關(guān)系，并通過(guò)代謝等方面的協(xié)同作用在提高瘤胃粗纖維降解能力中發(fā)揮了重要作用。瘤胃內(nèi)厭氧真菌由于其強(qiáng)大的粗纖維降解能力，在提高反芻動(dòng)物粗飼料利用價(jià)值中扮演著尤為重要的角色。甲烷作為瘤胃代謝的終產(chǎn)物之一，它的產(chǎn)生既是動(dòng)物能量的浪費(fèi)，同時(shí)，也對(duì)溫室效應(yīng)有一定影響，因此瘤胃甲烷菌及甲烷形成機(jī)制的研究受到廣泛關(guān)注。甲烷菌作為瘤胃中

2、主要的氫利用菌，可利用厭氧真菌的代謝產(chǎn)物如H2、CO2、甲酸和乙酸等產(chǎn)生甲烷。因此，瘤胃內(nèi)厭氧真菌與甲烷菌在瘤胃粗纖維降解產(chǎn)生甲烷過(guò)程中存在較為密切的關(guān)系。目前有關(guān)于厭氧真菌與甲烷菌代謝關(guān)系的研究主要集中在單獨(dú)厭氧真菌與某些已知甲烷菌的簡(jiǎn)單混合培養(yǎng)，有關(guān)于自然條件下共生的厭氧真菌與甲烷菌的相互代謝機(jī)制則鮮有報(bào)道。因此本研究擬通過(guò)厭氧滾管技術(shù)獲得厭氧真菌與甲烷菌自然條件下的簡(jiǎn)單共培養(yǎng)物，并對(duì)其中厭氧真菌與甲烷菌進(jìn)行鑒定以及動(dòng)態(tài)發(fā)酵研究，探

3、討瘤胃內(nèi)厭氧真菌與甲烷菌間的共存關(guān)系，為進(jìn)一步揭示瘤胃內(nèi)微生物間代謝關(guān)系奠定基礎(chǔ)。
　　第一部分:瘤胃降解粗纖維產(chǎn)甲烷的厭氧真菌與甲烷菌共培養(yǎng)物分離鑒定
　　本試驗(yàn)利用厭氧滾管技術(shù)從荷斯坦奶牛瘤胃中分離鑒定降解粗纖維產(chǎn)甲烷的厭氧真菌與甲烷菌共培養(yǎng)物，并通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察和DAPI染色以及甲烷菌16S rRNA基因序列分析方法分別對(duì)厭氧真菌及甲烷菌進(jìn)行鑒定。共培養(yǎng)物中的厭氧真菌分別屬于Piromyces、Neocallimasti

4、x和Caeomyces屬，所占百分比為53.57％、42.86％及3.57％。甲烷菌16S rRNA基因序列分析結(jié)果表明，共培養(yǎng)物中的甲烷菌均為甲烷短桿菌;其中，RO簇甲烷短桿菌比SGMT簇甲烷短桿菌更占優(yōu)勢(shì)，所占比例分別為96.43％和3.57％。本研究共獲得四種不同的厭氧真菌與甲烷菌組合，分別為Piromyces/Methanobrevibacter ruminantium、 Neocallimastix/Methanobrevib

5、acterruminantium、Neocallimastix/Methanobrevibacter thaueri以及Caecomyces/Methanobrevibacter ruminantium，分別占總組合數(shù)的53.57％、39.29％、3.57％及3.57％。分離得到的28株厭氧真菌和甲烷菌共培養(yǎng)物中，占優(yōu)勢(shì)的為具有豐富絲狀假根的厭氧真菌Piromyces和Neocallimastix以及RO簇甲烷短桿菌。本研究為進(jìn)一步研究

6、瘤胃內(nèi)厭氧真菌與甲烷菌相互代謝關(guān)系奠定基礎(chǔ)。
　　第二部分:GC-MS比較研究厭氧真菌與甲烷菌共培養(yǎng)物及厭氧真菌純培養(yǎng)物代謝差異
　　本試驗(yàn)以厭氧真菌（Piromyces sp.F1）與甲烷菌（Methanobrevibacter thaueri likestrain）共培養(yǎng)物為試驗(yàn)菌株，利用氯霉素抑制共培養(yǎng)物中的共生甲烷菌獲得厭氧真菌純培養(yǎng)物。通過(guò)GC-MS比較研究厭氧真菌與甲烷菌共培養(yǎng)物及厭氧真菌純培養(yǎng)物間胞內(nèi)與胞外代謝

7、物差異，評(píng)價(jià)甲烷菌共存對(duì)厭氧真菌代謝的影響。偏最小二乘判別分析(PLS-DA)結(jié)果表明，純培養(yǎng)和共培養(yǎng)的上清液以及細(xì)胞內(nèi)容物都能夠得到明顯區(qū)分。兩組上清液中主要差異代謝物為蘋(píng)果酸、丙酮酸、檸檬酸和乳酸。厭氧真菌純培養(yǎng)中的乳酸、檸檬酸和蘋(píng)果酸含量顯著高于厭氧真菌與甲烷菌共培養(yǎng)(P＜0.05），丙酮酸含量則顯著低于共培養(yǎng)(P＜0.05）。兩組細(xì)胞內(nèi)容物中主要差異代謝物為檸檬酸、葡萄糖、蘋(píng)果酸和丙酮酸，其中純培養(yǎng)的檸檬酸含量顯著低于共培養(yǎng)(P

8、＜0.05），葡萄糖的含量則顯著高于共培養(yǎng)(P＜0.05），而丙酮酸和蘋(píng)果酸的含量均低于共培養(yǎng)組，但差異不顯著(P＞0.05）。試驗(yàn)結(jié)果暗示甲烷菌能夠使厭氧真菌氫化酶體的代謝加強(qiáng)，從而改變厭氧真菌的代謝途徑。
　　第三部分:厭氧真菌代謝產(chǎn)物中有機(jī)酸的高效液相色譜檢測(cè)方法的建立
　　為進(jìn)一步探究厭氧真菌的代謝圖譜以及存在甲烷菌的情況下厭氧真菌代謝產(chǎn)物的變化，本試驗(yàn)利用高效液相色譜法建立了一種能夠迅速分析檢測(cè)厭氧真菌純培養(yǎng)以及與

9、甲烷菌共培養(yǎng)條件下的上清液和細(xì)胞內(nèi)容物中6種有機(jī)酸的方法。該方法采用5mM磷酸二氫鉀緩沖液(用磷酸調(diào)節(jié)至pH2.4)作為流動(dòng)相，流速為0.5 mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為214nm，柱溫25℃，使得甲酸、乙酸、琥珀酸、檸檬酸、乳酸和α-酮戊二酸6種有機(jī)酸能夠在14 min內(nèi)得到良好分離，各種有機(jī)酸的線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)均大干0.9992，檢測(cè)限為0.20 ng/L-1 ng/L，該方法的回收率為92.17％-101.61％，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.0

10、7％-8.30％。應(yīng)用上述方法，本試驗(yàn)研究了厭氧真菌純培養(yǎng)及與甲烷菌共培養(yǎng)的上清液和細(xì)胞內(nèi)容物中6種有機(jī)酸的差異。結(jié)果表明，純培養(yǎng)組的上清液和細(xì)胞內(nèi)容物中的甲酸都顯著高于共培養(yǎng)組(P＜0.05），而乙酸都顯著低于共培養(yǎng)組(P＜0.05)。琥珀酸和α-酮戊二酸在上清液和細(xì)胞內(nèi)容物組中的含量都較低，且在各組中差異不顯著(P＞0.05)。純培養(yǎng)上清液的乳酸含量顯著高于共培養(yǎng)(P＜0.05），而細(xì)胞內(nèi)容物中的的乙醇含量顯著高于共培養(yǎng)(P＜0.0

11、5）?？傊?，該法可用于厭氧真菌純培養(yǎng)及與甲烷菌共培養(yǎng)的發(fā)酵液及細(xì)胞內(nèi)容物中的的有機(jī)酸分析，試驗(yàn)結(jié)果表明甲烷菌存在與否對(duì)厭氧真菌的代謝產(chǎn)物存在較大影響。
　　第四部分:厭氧真菌與甲烷菌共培養(yǎng)物及厭氧真菌純培養(yǎng)物發(fā)酵動(dòng)態(tài)的比較研究
　　本試驗(yàn)結(jié)合已建立的高效液相代謝產(chǎn)物測(cè)定方法，以葡萄糖為底物，研究厭氧真菌組和厭氧真菌與甲烷菌共培養(yǎng)組發(fā)酵96 h過(guò)程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，以進(jìn)一步探究厭氧真菌代謝圖譜以及共生情況下甲烷菌

12、對(duì)厭氧真菌代謝途徑的動(dòng)態(tài)影響。結(jié)果表明，共培養(yǎng)組的累計(jì)產(chǎn)氣量顯著高于純培養(yǎng)組(P＜0.05）。共培養(yǎng)組的甲酸含量在30h前與純培養(yǎng)組差異不顯著，48 h后共培養(yǎng)組甲酸迅速降低，而純培養(yǎng)組甲酸不斷積累。純培養(yǎng)組的乳酸和乙醇始終高于共培養(yǎng)組，且分別在60 h和30 h后與共培養(yǎng)組差異顯著(P＜0.05），而共培養(yǎng)組的乙酸含量始終高于純培養(yǎng)組(P＜0.05)。共培養(yǎng)組和純培養(yǎng)組的α-酮戊二酸、檸檬酸和琥珀酸的含量在96 h內(nèi)均存在波動(dòng)性上升的