山莨菪堿對家兔完全性腦缺血再灌注損傷保護作用的實驗研究.pdf

1、腦復(fù)蘇是心肺復(fù)蘇后的重點和難點，而全腦缺血再灌注損傷是影響腦復(fù)蘇的關(guān)鍵。由于其發(fā)病機制復(fù)雜，目前臨床上尚缺乏足夠有效的藥物治療方法。山莨菪堿是一種良好的細(xì)胞保護劑，具有多種藥理作用，對心、肺、肝、腎、小腸等器官缺血再灌注損傷具有保護作用，但對全腦缺血再灌注損傷的保護作用缺乏系統(tǒng)研究。本研究通過觀察山莨菪堿對家兔完全性腦缺血再灌注損傷過程中腦組織游離鈣、興奮性氨基酸、脂質(zhì)過氧化、線粒體功能、腦組織能量代謝、NO、ET-1、TXA2/PGI

2、2比值、神經(jīng)元凋亡、腦組織超微結(jié)構(gòu)及動物生存狀況的影響，旨在探討其腦保護作用機制，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。 第一部分:山莨菪堿對急性完全性腦缺血及再灌注期間腦組織[Ca2+]i、興奮性氨基酸和超微結(jié)構(gòu)的影響 目的：研究山莨菪堿對急性完全性腦缺血及再灌注后腦組織細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+([Ca2+]i)、興奮性氨基酸釋放及超微結(jié)構(gòu)的影響。 方法：采用“閉塞雙側(cè)頸總動脈和椎動脈+體循環(huán)低血壓法”建立家兔急性完全性腦缺血再灌

3、注模型，缺血20min，再灌注2h。40只家兔隨機分為假手術(shù)組、缺血組、缺血再灌注組、治療組，治療組于再灌注前1min由股靜脈給予山莨菪堿，劑量為10mg/kg體重，繼而以微泵按5mg/h速度維持2h。采用Fura-2/Am為指示劑測定腦組織[Ca2+]i、以腦內(nèi)微透析方法和高效液相色譜技術(shù)檢測神經(jīng)細(xì)胞外興奮性氨基酸濃度，電鏡觀察大腦皮層超微結(jié)構(gòu)。 結(jié)果：缺血組及缺血再灌注組大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞[Ca2+]i明顯高于假手術(shù)組(P＜0

4、.01)，而且缺血再灌注組[Ca2+]i明顯高于缺血組(P＜0.01)；缺血組大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞外谷氨酸、天門冬氨酸分別較假手術(shù)組升高7倍、5倍(P＜0.01)，缺血再灌注組谷氨酸和天門冬氨酸含量較缺血組明顯降低(P＜0.05)，但仍高于假手術(shù)組(P＜0.05)。隨著[Ca2+]i和興奮性氨基酸增加，腦組織超微結(jié)構(gòu)損傷明顯加重，缺血組神經(jīng)細(xì)胞膜呈節(jié)段性破壞，線粒體腫脹，染色質(zhì)聚集；再灌注組有的神經(jīng)細(xì)胞膜、線粒體膜崩解、細(xì)胞壞死，有的神經(jīng)細(xì)

5、胞體積縮小，細(xì)胞器萎縮，核染色質(zhì)固縮，沿核膜凝聚，出現(xiàn)凋亡。治療組于再灌注早期給予山莨菪堿治療后，腦皮質(zhì)[Ca2+]i和細(xì)胞外谷氨酸、天門冬氨酸濃度較缺血組及缺血再灌注組明顯降低(P＜0.01)，同時腦組織超微結(jié)構(gòu)損傷明顯減輕。 結(jié)論：山茛菪堿可通過阻斷Ca2+內(nèi)流，抑制興奮性氨基酸的過度釋放，保護腦組織超微結(jié)構(gòu)，減輕腦缺血再灌注損傷。 第二部分山莨菪堿對急性完全性腦缺血再灌注腦線粒體損傷和能量代謝的影響 目的：

6、研究山莨菪堿對急性完全性腦缺血及再灌注后腦線粒體呼吸功能、結(jié)構(gòu)損傷和腦組織能量代謝的影響。 方法：在第一部分研究的基礎(chǔ)上，以差速離心法提取腦線粒體，采用氧電極法測定線粒體呼吸功能，生化法測定線粒體呼吸鏈NADH脫氫酶、琥珀酸脫氫酶、細(xì)胞色素C氧化酶活性，巴比妥酸法測定線粒體丙二醛含量，酶熒光法測定腦組織ATP含量，并觀察線粒體超微形態(tài)結(jié)構(gòu)。 結(jié)果：缺血組和缺血再灌注組NAD鏈和FAD鏈呼吸控制率(RCR)、磷氧比(ADP

7、/O)、氧化磷酸化率(OPR)、NADH脫氫酶、琥珀酸脫氫酶、細(xì)胞色素C氧化酶活性及腦組織ATP含量均較假手術(shù)組顯著降低(p＜0.05，p＜0.01)；缺血再灌注組線粒體丙二醛(MDA)含量較假手術(shù)組及缺血組顯著升高(p＜0.01)。治療組RCR、ADP/O、OPR、呼吸酶的活性、ATP含量均較缺血組和缺血再灌注組明顯升高(p＜0.05，p＜0.01)，MDA含量較缺血再灌注組明顯降低(p＜0.01)，線粒體結(jié)構(gòu)損傷減輕。 結(jié)論

8、：山茛菪堿可通過穩(wěn)定線粒體膜、抑制脂質(zhì)過氧化，減輕線粒體結(jié)構(gòu)損傷，并促進缺血及再灌注后線粒體呼吸功能、呼吸鏈酶活性、ATP合成能力的恢復(fù)，從線粒體水平發(fā)揮腦保護作用。 第三部分山莨菪堿對家兔急性完全性腦缺血再灌注期間NO、ET-1、TXA2和PGI2代謝的影響 目的：探討山茛菪堿對全腦缺血再灌注期間腦組織NO、ET-1、TXA2和PGI2代謝的影響。 方法：在第一部分研究的基礎(chǔ)上，按硝酸鹽還原酶法測定腦組織NO含

9、量，按放免法測定ET-1、TXB2、6-keto-PGF1a含量。 結(jié)果：缺血組及缺血再灌注組NO、ET-1、TXB2和6-keto-PGF1a含量明顯高于假手術(shù)組(P＜0.05，P＜0.01)，而且再灌注期間NO、ET-1和TXB2含量及TXB2/6-keto-PGF1a比值進一步升高，高于缺血組(P＜0.05，P＜0.01)。而治療組上述指標(biāo)較缺血再灌注明顯降低(P＜0.05，P＜0.01)。 結(jié)論：山莨菪堿可通過減

10、少缺血再灌注早期NO的過量產(chǎn)生，抑制ET-1、TXA2合成、調(diào)節(jié)TXA2-PGI2平衡，改善腦微循環(huán)障礙，減輕腦缺血再灌注損傷。 第四部分:山茛菪堿對全腦缺血再灌注后神經(jīng)元凋亡及動物生存狀況的影響 目的：探討山茛菪堿對全腦缺血再灌注遲發(fā)損傷階段神經(jīng)元凋亡、動物生存狀況的影響及其抗凋亡機制。 方法：按第一部分方法建立全腦缺血再灌注損傷模型，缺血20min，再灌注24h、48h、72h，56只家兔隨機分為假手術(shù)組、缺

11、血再灌注組、治療組。采用TUNEL方法觀察皮層神經(jīng)元凋亡，免疫組化法觀察皮層Caspase-3、HSP70表達，并計算動物神經(jīng)功能缺陷評分(NDS)，評估動物的生存狀況。 結(jié)果：治療組于再灌注24h、48h、72hNDS均低于缺血再灌注組對應(yīng)時間點(P＜0.01)。與假手術(shù)組相比，缺血再灌注組大腦皮層TUNEL陽性細(xì)胞和Caspase-3陽性細(xì)胞明顯增多，而且隨再灌注時間的延長而增多。治療組于再灌注48h、72h，TUNEL陽性

12、細(xì)胞和Caspase-3陽性細(xì)胞較缺血再灌注對應(yīng)時間點顯著減少(P＜0.05，P＜0.01)。治療組HSP70免疫陽性細(xì)胞數(shù)量均明顯高于缺血再灌注組對應(yīng)時間點(P＜0.05，P＜0.01)。缺血再灌注組HSP70陽性細(xì)胞于再灌注24h后即逐漸減少，而治療組HSP70陽性細(xì)胞于再灌注48h后才開始減少。 結(jié)論：山莨菪堿可抑制腦缺血再灌注損傷階段神經(jīng)元凋亡，改善動物生存質(zhì)量；其抗凋亡機制與抑制Caspase-3的激活和上調(diào)HSP70