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文檔簡介
1、脂蛋白是一類具有復雜結構的生物大分子,具有一個由甘油三酯和膽固醇酯組成的疏水性脂質內核,被含有載脂蛋白和游離膽固醇的磷脂單分子層所包裹。磷脂單分子層上的載脂蛋白不僅穩(wěn)定磷脂層的結構,而且維持著脂蛋白的生物活性,在體內通過不同的受體將脂蛋白轉運到不同的細胞中進行代謝。脂蛋白作為內源性的大分子,具有生物可降解性和生物相容性,不會激發(fā)免疫反應,以及不會被單核細胞吞噬系統(tǒng)識別并清除,這些優(yōu)點使得脂蛋白具有作為輸送載體的潛力,從而近年來引起了廣泛
2、的關注和研究。
高密度脂蛋白(HDL)作為脂蛋白家族中的一員,主要參與了膽固醇逆向轉運過程,將外周細胞中的膽固醇逆向輸送到肝臟進行代謝。HDL中主要的載脂蛋白是載脂蛋白A-I,在膽固醇逆向轉運過程中起著重要的作用。載脂蛋白A-I通過巨噬細胞上的ATP結合盒轉運子A(1)(ABCA(1))與膽固醇組合成HDL,然后在肝臟上通過HDL的受體,清道夫受體B類Ⅰ型(SR-BI),使肝細胞選擇性攝取HDL中被酯化的膽固醇,這個過程即
3、膽固醇逆向轉運過程。HDL在肝細胞上的另一個受體是ATP合成酶的β鏈,介導了HDL的內吞,HDL在肝細胞內與內涵體結合,但沒有經(jīng)過溶酶體的降解,通過逆胞飲重新被排出肝細胞。
根據(jù)HDL的特性,例如較小的粒徑,被包裹的內核以及被受體調節(jié)的攝取,我們設想將高密度脂蛋白構建為一種肝臟主動靶向的載體,能夠將不同的物質輸送到肝臟中。
我們將含有密碼子優(yōu)化的載脂蛋白A-IcDNA的質粒轉入大腸桿菌表達載體BL21(DE3
4、)pLysS中,通過生物工程的方法分離純化得到大量的重組載脂蛋白A-I。我們驗證了重組載脂蛋白A-I具有與野生型載脂蛋白A-I同樣的生物活性,能夠與磷脂快速重組成HDL。
為了利用HDL參與膽固醇逆向轉運的特性,我們在膽固醇的3'位置上連接乙二胺,并且利用二乙烯三胺五乙酸(DTPA)雙酸酐的胺解反應將乙二胺-膽固醇連接到DTPA上,利用硅膠分離純化出兩種化合物:DTPA單酰胺(DTPA-chol)和DTPA雙酰胺產(chǎn)物(DT
5、PA-(chol)2)。將兩種產(chǎn)物分別與釓離子進行螯合,得到連接膽固醇基團的Gd-DTPA衍生物Gd-DTPA-chol和Gd-DTPA-(chol)2,使用核磁、高分辨質譜等方法對化合物進行了確認。我們計算出兩種釓螯合物的純度大于99.5%。
我們使用二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿(DMPC)、重組載脂蛋白A-I、釓螯合物通過膽酸鈉表面活性劑法組裝成重組Gd-HDL。使用NaBr密度梯度超速離心法進行分離純化。然后分別通過動態(tài)光散
6、射法、透射電鏡、MRI等方法對重組Gd-HDL進行研究,測定了重組Gd-HDL中的蛋白和釓螯合物的濃度,計算出NaBr密度梯度離心的樣品回收率;對重組Gd-HDL的粒徑、形態(tài)以及對水質子的縱向弛豫效率進行了表征,發(fā)現(xiàn)重組Gd-HDL的粒徑在20-25nm之間,形態(tài)為圓盤狀,并且其縱向弛豫效率r1要高于商業(yè)化的造影劑Gd-DTPA,Gd-chol-HDL的縱向弛豫效率比Gd-DTPA的提高78%,Gd-(chol)2-HDL的縱向弛豫效率
7、則比Gd-DTPA的提高了20%。
在體外細胞實驗中,利用人肝癌細胞HepG2細胞,我們發(fā)現(xiàn)重組Gd-HDL具有與野生型HDL相同的生物活性,能夠將釓螯合物輸送到HepG2細胞中,并且證明是通過細胞上的HDL受體將釓螯合物攝取到細胞中。然后使用CCK-8法測定了兩種重組Gd-HDL與商業(yè)化造影劑Gd-DTPA對HepG2細胞的毒性作用。
為了研究重組Gd-HDL作為造影劑在體內的成像效果,在大鼠的MRI實驗中
8、,通過尾靜脈注射劑量為10μmolGd/kg的重組Gd-HDL后,使用3TMRI儀器在不同的時間點進行掃描,獲得T1加權的MRI圖像。測量各個時間點的肝臟MRI信號,與注射前的信號進行比較,計算其相對強化率。發(fā)現(xiàn)兩種重組Gd-HDL能夠在低濃度下有效增強肝臟部位的MRI信號,并且持續(xù)到24小時仍然有較高的信號,表明重組Gd-HDL可以實現(xiàn)肝臟的磁共振靶向造影。并且大鼠的十二指腸部位的MRI信號也同樣得到了增強,表明釓螯合物可能通過膽固醇
9、代謝途徑進行代謝,而且Gd-DTPA-chol和Gd-DTPA-(chol)2可能分別代表了膽固醇不同的代謝途徑。
我們對重組HDL作為質粒DNA靶向輸送的載體進行了研究。在體外細胞實驗中,重組HDL在組裝有陽離子膽固醇衍生物CDAN后,能夠實現(xiàn)DNA靶向輸送和提高轉染效果的實驗目標。在體內實驗中,我們研究了重組HDL在小鼠體內的分布,表明重組HDL主要聚集在肝臟部位,而且持續(xù)的時間較長。
我們也對重組HDL
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