TNF-α與阿爾茲海默患者白日嗜睡的關(guān)系及其機(jī)制研究.pdf

1、第一部分輕中度阿爾茨海默病人血清中TNF-α及IL-1β的水平與其睡眠障礙的關(guān)系
　　 研究背景和目的
　　 阿爾茨海默(AD)患者的睡眠障礙現(xiàn)象十分常見，對(duì)其配偶及照顧者產(chǎn)生了十分嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)。其特征性睡眠結(jié)構(gòu)變化在表現(xiàn)為睡眠效率、總睡眠時(shí)間，REM睡眠比例的減少以及REM期腦波的明顯慢化。研究者針對(duì)AD患者的睡眠障礙發(fā)生原因進(jìn)行了多方面的研究。如褪黑素和皮質(zhì)醇分泌水平的減低及分泌晝夜節(jié)律紊亂，伴隨著AD患者社交行為減少

2、的光照時(shí)間及強(qiáng)度的降低，視交叉上核的退行性病理改變等。但以上研究并沒有得出一個(gè)明確的結(jié)論。IL-1β及TNF-α作為在AD起病中具有重要作用的炎癥因子，其在AD患者睡眠障礙中的作用尚未有研究者進(jìn)行探討。本實(shí)驗(yàn)將從細(xì)胞因子與睡眠的關(guān)系入手，探討AD患者血清中IL-1β及TNF-α水平與AD患者睡眠障礙的關(guān)系，同時(shí)進(jìn)一步為神經(jīng)炎癥學(xué)說在AD發(fā)病中的機(jī)制提供證據(jù)支持。
　　 實(shí)驗(yàn)方法
　　 一、研究對(duì)象采用性別及年齡配對(duì)的病例

3、對(duì)照研究，選擇輕中度AD患者43例和健康老人22例。根據(jù)MMSE分值區(qū)分輕中度AD患者，健康對(duì)照組采用年齡性別配對(duì)的AD患者家屬。
　　 二、實(shí)驗(yàn)流程在門診對(duì)符合上述診斷標(biāo)準(zhǔn)的AD病人進(jìn)行詳細(xì)的病史采集，相應(yīng)的神經(jīng)科檢查，精神狀態(tài)評(píng)估，癡呆病人常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢查。符合入組標(biāo)準(zhǔn)的病人及對(duì)照組使用匹茲堡睡眠質(zhì)量指數(shù)(PSQI)、愛潑沃斯嗜睡量表(ESS)進(jìn)行主觀睡眠評(píng)價(jià)指標(biāo)，使用多導(dǎo)睡眠圖(PSG)連續(xù)監(jiān)測(cè)2個(gè)晚上的睡H民結(jié)構(gòu)及相應(yīng)睡眠

4、改變。在多導(dǎo)睡眠圖檢查結(jié)束后次日清晨8:00一次性抽肘靜脈取血2mL，在室溫下離心后吸出血清層，置-80℃超低溫貯存。使用IL-1β和TNF-αELSIA試劑盒對(duì)血清中IL-1β和TNF-α水平進(jìn)行檢測(cè)。
　　 結(jié)果
　　 一、與對(duì)照組相比，輕中度AD患者的睡眠效率更低、覺醒次數(shù)及時(shí)間更多、慢波睡眠明顯減少。
　　 二、IL-1β在AD患者外周血清中的檢出率很低。
　　 三、輕中度AD患者與對(duì)照組之間的T

5、NF-α水平無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差別。
　　 四、當(dāng)將AD患者根據(jù)其ESS得分分為伴白日嗜睡組及不伴白日嗜睡組后，發(fā)現(xiàn)伴有白日嗜睡組的AD患者的血清TNF-α的水平明顯高于不伴白日嗜睡的AD患者組及對(duì)照組TNF-α水平。
　　 五、血清TNF-α的水平與ESS得分呈明顯正相關(guān)。
　　 結(jié)論
　　 輕中度患者AD患者的血清水平升高與其白日嗜睡程度相關(guān)。
　　 第二部分TNF-α-NF-κB信號(hào)通路介導(dǎo)癡呆模

6、型大鼠的夜間睡眠增多
　　 研究背景和目的
　　 除了記憶力衰退外，許多阿爾茨海默(AD)病人出現(xiàn)不同表現(xiàn)及程度的睡眠障礙。阿爾茨海默病人最常出現(xiàn)的睡眠障礙包括夜間覺醒時(shí)間的增多及白日嗜睡。許多研究指出炎癥在AD的發(fā)病過程中起著十分重要的作用。而炎癥在AD的發(fā)生發(fā)展中主要是通過促炎細(xì)胞因子TNF-α及IL-1β來完成的。除了促炎作用外，TNF-α也被認(rèn)為具有調(diào)節(jié)生理性睡眠的作用。我們既往有關(guān)AD患者的臨床實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AD患者

7、的白日嗜睡可能與TNF-α的分泌增多相關(guān)，TNF-α可能是引起AD患者白日嗜睡的原因之一。為了進(jìn)一步驗(yàn)證我們的推測(cè)，我們準(zhǔn)備在AD大鼠模型上對(duì)TNF-α及其下游的轉(zhuǎn)錄因子NF-κB與AD大鼠模型睡眠結(jié)構(gòu)變化的關(guān)系進(jìn)行研究。
　　 實(shí)驗(yàn)方法
　　 使用Abeta1-40寡聚體注入大鼠側(cè)腦室建立大鼠癡呆模型，觀察其睡眠結(jié)構(gòu)改變。模型建立后側(cè)腦室注入TNF受體片段及NF-κB抑制劑并觀察其對(duì)大鼠睡眠結(jié)構(gòu)的影響。檢測(cè)TNF-α在

8、癡呆大鼠海馬的免疫組化表達(dá)水平。使用Westerenbolt來檢測(cè)癡呆大鼠海馬區(qū)的TNF-α含量。使用酶聯(lián)免疫反應(yīng)(ELISA)檢測(cè)癡呆大鼠皮質(zhì)、下丘腦及海馬的TNF-α含量。使用NOSHIFTTM轉(zhuǎn)錄活性測(cè)試方法來檢測(cè)癡呆大鼠皮質(zhì)、下丘腦及海馬的NF-κB活性。
　　 結(jié)果
　　 一、術(shù)后14d老年癡呆模型組與空白對(duì)照組相比在前5天的定位巡航試驗(yàn)中逃逸潛伏期明顯延長(zhǎng)，指針測(cè)試中目標(biāo)象限百分比明顯下降。
　　 二

9、、免疫組化分析結(jié)果表示與對(duì)照組相比，AD模型組的大鼠海馬區(qū)的TNF-α表達(dá)增多。
　　 三、Western blot分析顯示AD模型組海馬TNF-α蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組表達(dá)水平。
　　 四、與對(duì)照組相比，ELISA檢測(cè)結(jié)果提示AD模型組的海馬及下丘腦組織中的TNF-α濃度明顯增高，而大腦皮質(zhì)中的TNF-α濃度兩組之間無明顯差別。
　　 五、對(duì)照組大鼠側(cè)腦室注入生理鹽水7天后其睡眠結(jié)構(gòu)并物明顯變化。與對(duì)照組相

10、比AD組大鼠造模7天后夜間的慢波睡眠(SWS)期比例從19.3％上升到23.1％(N=8；F=14.807，P<0.05)。白日的SWS期比例從57.6％下降到55.6％(N=8；F=7.657，P>0.05)無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與對(duì)照組相比AD組大鼠造模7天后夜間及白日的(快速動(dòng)眼睡眠)REM期比例變化方向不定，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與對(duì)照組相比AD組大鼠造模7天后夜間的清醒時(shí)間(WAKE)比例從77.4％下降到74.0％(N=8；F=67.9

11、12，P<0.05)。白日的清醒時(shí)間比例從30.7％上升到32.5％(N=8；F=17.657，P>0.05)無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 六、從側(cè)腦室給予AD模型大鼠25ugTNF受體片段后，AD模型組大鼠的夜間的SWS期比例從23.1％下降到19.7％(N=8；F=18.927，P<0.05)。白日的SWS期比例從55.6％上升到56.7％(N=8；F=6.7847，P>0.05)無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。從側(cè)腦室給予AD模型大鼠25u

12、gTNF受體片段后AD模型大鼠夜間及白日的REM期比例變化方向不定，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。從側(cè)腦室給予AD模型大鼠25ugTNF受體片段后，其夜間的清醒時(shí)間(WAKE)比例從74.0％上升到77.2％(N=8；F=56.325，P<0.05)。白日的清醒時(shí)間比例從32.5％下降到31.3％(N=8；F=13.435，P>0.05)無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 七、與對(duì)照組相比，AD模型組大鼠的海馬及下丘腦中的NF-κB活性高于對(duì)照組大鼠的海

13、馬及下丘腦中的NF-κB活性(海馬；130.7±38.9VS57.6±23.1P<0.05下丘腦；223.9±61.3VS75.2±45.7P<0.05)。
　　 八、從側(cè)腦室給予大鼠NF-κB抑制劑BAY11-708510umol后，AD模型大鼠的SWS及REM期睡眠比例無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)變化。而從側(cè)腦室給予大鼠NF-κB抑制劑BAY11-708520umol后，AD模型大鼠的SWS比例從24.7％±4.8下降到18.6％±3.5(