α1Na,K-ATPase和PDCD5在C57BL-6J小鼠耳蝸的年齡相關(guān)性表達(dá)及其與AHL的關(guān)系.pdf

1、第一部分成年小鼠耳蝸血管紋緣細(xì)胞的原代分離培養(yǎng)及鑒定
　　目的：建立成年小鼠耳蝸血管紋邊緣細(xì)胞(marginal cell，MC)的體外培養(yǎng)及鑒定方法，為進(jìn)一步研究成年期MC的生理功能提供實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。
　　方法：顯微分離成年期小鼠耳蝸血管紋組織,以Ⅱ型膠原酶消化原代培養(yǎng)邊緣細(xì)胞,將其接種于六孔板中貼壁生長，加入含有15％胎牛血清、表皮生長因子、氫化可的松、胰島素、三碘甲狀腺原氨酸等促進(jìn)細(xì)胞生長的完全培養(yǎng)基，在5％CO2/95％

2、空氣的37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞生長情況，換液一周兩次或培養(yǎng)基顏色變渾濁。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，噻唑藍(lán)(MTT)法測細(xì)胞的生長曲線,透射電鏡觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，免疫熒光法檢測上皮細(xì)胞的標(biāo)志物-中間絲角蛋白18（CK18）和耳蝸血管紋的獨(dú)特標(biāo)志物KCNQ1的表達(dá)，RT-PCR檢測CK18和KCNQ1mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果：倒置顯微鏡下可見接種24～48h后細(xì)胞貼壁增殖,形成大小不等的細(xì)胞島，一周后，細(xì)胞迅速生長，相

3、互融合,緊密連接，形成單層極性上皮層,呈典型的“鋪路石”樣外觀。透射電鏡觀察可見多角形細(xì)胞表面有較多微絨毛,胞漿內(nèi)線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器豐富。免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測顯示CK18和KCNQ1蛋白表達(dá)陽性，RT-PCR結(jié)果示CK18和KCNQ1的mRNA均有表達(dá)。
　　結(jié)論：采用原代消化培養(yǎng)技術(shù)，成功建立成年小鼠耳蝸血管紋MC的體外原代培養(yǎng)，為進(jìn)一步研究成年期MC的功能和某些內(nèi)耳疾病的發(fā)病機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)細(xì)胞基礎(chǔ)。
　　第二部分

4、α1Na,K-ATPase通道蛋白在C57BL/6J小鼠耳蝸的年齡相關(guān)性表達(dá)及其與AHL的關(guān)系
　　目的：研究α1Na，K-ATPase離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在不同年齡段C57BL/6J（C57）小鼠耳蝸血管紋的表達(dá)及其意義。
　　方法：選擇3M,6M,9M,12M月齡C57J小鼠各12只，采用聽性腦干反應(yīng)（Auditory Brainstem Response，ABR）分別檢測其聽力變化。采用免疫組織熒光法和免疫印跡雜交Wester

5、n blot（WB）檢測α1Na,K-ATPase蛋白在小鼠耳蝸的表達(dá)變化，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法（RT-PCR）檢測各年齡段小鼠耳蝸α1Na,K-ATPase mRNA在不同鼠齡小鼠耳蝸中的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：隨著鼠齡的增長，C57小鼠各頻率ABR閾值逐漸升高，自6月齡小鼠的ABR反應(yīng)閾逐漸增加，其數(shù)值與低齡組小鼠相比其差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。免疫熒光檢測顯示α1Na,K-ATPase主要分布于血管紋底側(cè)膜和螺旋韌

6、帶，表達(dá)量也隨著鼠齡的增加呈現(xiàn)減少的趨勢，Real-Time PCR檢測顯示α1Na,K-ATPase mRNA隨著小鼠年齡的增長其表達(dá)逐漸下調(diào)，與其蛋白變化趨勢相一致。
　　結(jié)論：C57小鼠耳蝸α1Na,K-ATPase的表達(dá)隨著年齡的增加而逐漸下降，可能與年齡相關(guān)性聽力損失具有一定聯(lián)系。
　　第三部分α1Na,K-ATPas通道蛋白在成年C57BL/6J小鼠血管紋邊緣細(xì)胞的表達(dá)和意義
　　目的：初步研究α1Na,K

7、-ATPase在血管紋緣細(xì)胞的表達(dá)和意義，為進(jìn)一步探索耳蝸K＋循環(huán)提供實(shí)驗(yàn)研究基礎(chǔ)。
　　方法：采用膠原酶消化法體外分離培養(yǎng)成年小鼠耳蝸血管紋邊緣細(xì)胞。采用免疫組織熒光法檢測α1Na,K-ATPase在血管紋邊緣細(xì)胞的表達(dá)和分布，并運(yùn)用RT-PCR檢測α1Na,K-ATPase mRNA在邊緣細(xì)胞的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：體外成功培養(yǎng)和純化了血管紋邊緣細(xì)胞，免疫熒光檢測可見有α1Na,K-ATPase陽性表達(dá)，主要位于細(xì)胞膜，

8、RT-PCR也檢測到α1Na,K-ATPase mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)論：α1Na,K-ATPase在血管紋緣細(xì)胞表達(dá)，可能參與了耳蝸K＋循環(huán)形成，在維持正常耳蝸聽力中起重要作用。
　　第四部分凋亡相關(guān)蛋白PDCD5在C57BL/6J小鼠耳蝸毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的年齡相關(guān)性表達(dá)及與老年性的關(guān)系
　　目的：研究PDCD5和caspase-3在不同年齡段C57BL/6J（C57）小鼠耳蝸毛細(xì)胞、血管紋及螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的

9、表達(dá)，初步探討其在年齡相關(guān)性聽力下降發(fā)生、發(fā)展中的作用。
　　方法：選擇C57小鼠3M,6M,9M,12M月齡段各15只，分為四組。對(duì)各組小鼠雙側(cè)click、6、8 kHz ABR閾值檢測。采用免疫組織化學(xué)法和Western blotting（WB）檢測各月齡段小鼠耳蝸PDCD5和caspase-3蛋白的表達(dá)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-Time PCR）檢測各月齡段小鼠耳蝸PDCD5和Caspase-3基因mRNA的表達(dá)變化。

10、
　　結(jié)果：隨著年齡的增長，C57小鼠各頻率ABR閾值逐漸提高，耳蝸PDCD5和caspase-3蛋白的表達(dá)亦逐漸增強(qiáng)。3月齡和6月齡小鼠耳蝸毛細(xì)胞和血管紋細(xì)胞及螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞僅出現(xiàn)少量PDCD5和caspase-3蛋白表達(dá)，9月齡時(shí)表達(dá)有明顯增加，至12月齡時(shí)表達(dá)最強(qiáng)，各組間相比有顯著性差異(P＜0.05)。Real-Time PCR檢測顯示PDCD5和Caspase-3基因mRNA隨著小鼠年齡的增長其表達(dá)逐漸增強(qiáng)，與其蛋白變化