炎癥應(yīng)激加重高脂飲食喂養(yǎng)的C57BL-6J小鼠胰島功能損傷的研究.pdf

1、第一部分炎癥應(yīng)激加重高脂飲食喂養(yǎng)的C57BL/6J小鼠胰島β細(xì)胞功能損傷
　　目的:2型糖尿病(type2 diabetes，T2DM)與肥胖密切相關(guān)，但是并非所有的肥胖患者最終都發(fā)展成T2DM，這其中涉及的具體機(jī)制還不清楚。本研究主要通過酪蛋白(Casein)隔日皮下注射高脂飲食喂養(yǎng)的C57BL/6J小鼠14周，誘導(dǎo)慢性系統(tǒng)性炎癥，觀察在肥胖狀態(tài)下，炎癥應(yīng)激對(duì)小鼠胰島β細(xì)胞功能的影響以及探討其潛在的機(jī)制。
　　方法:8周齡

2、的雄性C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為正常飲食組(normalchow diet，NCD)、高脂飲食組（high fat diet，HFD）和高脂飲食+炎癥(Casein)組(HFD+Casein)。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linkedimmunosorbent assay, ELISA)測定血清中炎癥因子、游離脂肪酸、葡萄糖及胰島素水平。酶法檢測血清和脂肪組織中甘油三酯含量。WesternBlot檢測各組織中炎癥因子表達(dá)及胰島素信

3、號(hào)通路主要蛋白水平。葡萄糖耐量及胰島素耐量試驗(yàn)用于分析機(jī)體胰島素敏感性，判斷是否存在胰島素抵抗。胰腺組織蘇木素-伊紅(haematoxylin-eosin，HE)染色和胰島素免疫組化試驗(yàn)觀察胰島形態(tài)大小及功能水平。末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記法(terminal deoxynucleotidyltransferase-mediated dUTP nick-end labeling，TUNEL)聯(lián)合胰島素免疫熒光染色評(píng)估

4、β細(xì)胞凋亡情況。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(polymerase chainreaction)技術(shù)檢測胰腺組織中胰島素合成、分泌及β細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)。
　　結(jié)果:HFD喂養(yǎng)14周后，C57BL/6J小鼠體重、脂肪/體重比明顯增加，并出現(xiàn)了明顯的高脂血癥(P＜0.05)。但與NCD組相比，HFD組小鼠血清炎癥因子并沒有顯著變化。Casein注射14周成功誘導(dǎo)了慢性系統(tǒng)性炎癥的體內(nèi)模型，表現(xiàn)為血清中炎癥因子血清淀粉樣蛋白A(serum a

5、myloid A，SAA)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factorα，TNF-α)濃度較NCD組和HFD組明顯升高(P＜0.05);脂肪、肝臟和肌肉組織中TNF-α、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractantprotein-1，MCP-1)的蛋白水平也明顯增加。同時(shí)，HFD+Casein組小鼠胰島中出現(xiàn)了明顯的巨噬細(xì)胞浸潤。葡萄糖耐量和胰島素耐量試驗(yàn)顯示:HFD組小鼠葡萄糖負(fù)荷30、60

6、、120min時(shí)的血糖水平明顯高于NCD組(P＜0.05)，表明HFD喂養(yǎng)14周引起了小鼠葡萄糖耐量降低。注射胰島素后，HFD組小鼠血糖下降緩慢且血糖水平仍較NCD組高(P＜0.05)。Casein注射進(jìn)一步加重了HFD喂養(yǎng)的小鼠葡萄糖不耐受的程度，表現(xiàn)為空腹及注射葡萄糖15、120min時(shí)的血糖顯著高于HFD組(P＜0.05)。炎癥應(yīng)激顯著抑制肝臟、肌肉和脂肪組織中胰島素受體底物1(insulin receptor substrate

7、1，IRS1)和磷酸化蛋白激酶AKT(p-AKT)表達(dá)(P＜0.05)，進(jìn)一步加重HFD所致的胰島素信號(hào)通路損傷。胰腺組織形態(tài)學(xué)結(jié)果:炎癥應(yīng)激促使HFD喂養(yǎng)的小鼠的胰島體積明顯減小、胰島素含量明顯降低。進(jìn)一步分析，慢性炎癥明顯下調(diào)HFD喂養(yǎng)的小鼠的胰島素合成基因胰十二指腸同源盒基因(pancreatic andduodenal homeobox-1，PDX-1)和分泌基因葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(glucosetransporter2，GLUT

8、2)、葡萄糖激酶(glucokinase，GK)的表達(dá)(P＜0.05)，并且顯著增加了胰島β細(xì)胞凋亡數(shù)量和胰腺組織中Bax/Bcl2 mRNA水平(P＜0.05)。
　　結(jié)論:炎癥應(yīng)激加重高脂飲食喂養(yǎng)的C57BL/6J小鼠胰島β細(xì)胞功能損傷，降低胰島素合成、分泌基因的表達(dá)，并且增加β細(xì)胞凋亡。這表明，肥胖個(gè)體在合并慢性炎癥應(yīng)激時(shí)更容易發(fā)生胰島β細(xì)胞功能損傷，且更易發(fā)展成為T2DM。
　　第二部分雷帕霉素加重炎癥應(yīng)激引起的C5

9、7BL/6J小鼠胰島功能損傷
　　目的:本課題組前期研究已經(jīng)證實(shí)，雷帕霉素(Rapamycin，Rapa)可明顯改善由炎癥介導(dǎo)的胰島素信號(hào)通路的損傷，改善胰島素抵抗，但卻引起了更嚴(yán)重的葡萄糖不耐受。因此下一步研究觀察Rapa對(duì)慢性系統(tǒng)性炎癥狀態(tài)下C57BL/6J小鼠胰島β細(xì)胞功能的影響。
　　方法:8周齡的雄性C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為溶媒組(Vehicle，Veh)和雷帕霉素組(Rapa)。Rapa組處理:高脂飲食喂養(yǎng)，

10、且隔日皮下注射10％ Casein及0.2ml Rapamycin; Veh組處理:高脂飲食喂養(yǎng)，加隔日皮下注射10％ Casein及0.2ml Vehicle。均處理14周。ELISA法測定血清胰島素水平。葡萄糖耐量及胰島素耐量試驗(yàn)用于評(píng)估糖代謝能力。胰腺組織HE染色和胰島素免疫組化染色觀察胰島形態(tài)大小及功能水平。TUNEL法聯(lián)合胰島素免疫熒光染色評(píng)估β細(xì)胞凋亡情況。Real-timePCR技術(shù)檢測胰腺組織中胰島素合成、分泌及β細(xì)胞凋

11、亡相關(guān)基因表達(dá)。
　　結(jié)果:葡萄糖耐量及胰島素耐量試驗(yàn)結(jié)果:負(fù)荷葡萄糖后，Rapa組小鼠血糖水平較Veh組明顯增高，特別是在負(fù)荷葡萄糖30，60及120min時(shí)(P＜0.05);注射胰島素后，Rapa組血糖下降緩慢，且一直較Veh組高(P＜0.05)，這表明雷帕霉素加重了由炎癥應(yīng)激導(dǎo)致的葡萄糖不耐受的程度。Rapa組小鼠胰島體積較Veh組明顯減小，且胰島素免疫組化染色明顯較Veh組淡，同時(shí)伴隨血清胰島素水平顯著降低(P＜0.05)

12、，表明雷帕霉素進(jìn)一步損傷炎癥應(yīng)激狀態(tài)下C57BL/6J小鼠胰島功能，致胰島素含量明顯減少。胰腺組織PCR結(jié)果顯示:雷帕霉素導(dǎo)致胰島素合成分泌的關(guān)鍵基因PDX-1、GLUT2和GK的表達(dá)顯著下調(diào)(P＜0.05)。與Veh組相比，Rapa組小鼠胰島β細(xì)胞凋亡明顯增加，并且促癌基因Bax與抑癌基因Bcl2的比值增大(P＜0.05)。
　　結(jié)論:雷帕霉素加重炎癥應(yīng)激引起的C57BL/6J小鼠胰島功能損傷，進(jìn)一步減少胰島素的合成與分泌，并增