白藜蘆醇對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的C57BL-6J小鼠骨性關(guān)節(jié)炎模型干預(yù)效果研究.pdf

1、骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是以關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行性損害為主要特征的慢性關(guān)節(jié)疾病。OA的病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，但肥胖是OA危險(xiǎn)因素之一。肥胖患者體重增加不僅通過(guò)增加膝關(guān)節(jié)負(fù)荷導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)OA，同時(shí)改變膝關(guān)節(jié)生物學(xué)機(jī)制，從而進(jìn)一步導(dǎo)致OA發(fā)發(fā)展。在研究肥胖參與OA的發(fā)病機(jī)制時(shí)，利用高脂飲食誘導(dǎo)小鼠發(fā)生OA，可能是研究肥胖與OA關(guān)系的有效方法。
　　OA為退行性病變，其發(fā)生發(fā)展過(guò)程為不可逆，所以能夠早期發(fā)現(xiàn)和預(yù)防OA

2、發(fā)生尤為重要。白藜蘆醇（resveratrol，RES）作為一種天然的多酚類化合物，具有抗氧化、抗炎性、抗衰老、抗凋亡和調(diào)節(jié)糖脂代謝等多種作用。許多體外及體內(nèi)研究結(jié)果均表明RES可以拮抗OA的發(fā)生發(fā)展，但其作用機(jī)制并未完全闡明。
　　目的：
　　本研究擬利用高脂飲食誘導(dǎo)C57BL/6J小鼠發(fā)生肥胖的方法建立OA動(dòng)物模型，通過(guò)血清學(xué)、病理學(xué)、軟骨細(xì)胞凋亡來(lái)判定OA的發(fā)生情況;同時(shí)進(jìn)行不同劑量RES干預(yù)，觀察RES對(duì)OA的干預(yù)效

3、果，為探討OA與肥胖的關(guān)系及OA的營(yíng)養(yǎng)防治措施提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　一、動(dòng)物的分組
　　將60只C57BL/6J雄性小鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后按體重隨機(jī)分為對(duì)照組、高脂組、RES低劑量干預(yù)組（低劑量組）、RES中劑量干預(yù)組（中劑量組）及RES高劑量干預(yù)組（高劑量組），每組12只，對(duì)照組喂食基礎(chǔ)飼料，高脂組和干預(yù)組喂食高脂飼料。
　　二、動(dòng)物處理及樣品采集
　　對(duì)照組和高脂組給予0.5％羧甲基纖維素鈉(

4、CMC)水溶液灌胃。干預(yù)各組給予0.5％CMC與RES懸濁液灌胃，其中低劑量組RES干預(yù)劑量為5mg/kg/d;中劑量組RES干預(yù)劑量為22.5mg/kg/d;高劑量組RES干預(yù)劑量為45mg/kg/d。各組小鼠均自由進(jìn)食和飲水，每周稱重，共計(jì)12周。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)束后收集小鼠血清，-80℃保存?zhèn)溆?。取小鼠左下肢膝關(guān)節(jié)，固定、脫鈣后進(jìn)行石蠟包埋，切5μm組織切片備用。
　　三、檢測(cè)指標(biāo)
　?。ㄒ唬w重
　?。ǘ┭?/p>

5、清甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)水平采用酶偶聯(lián)比色法檢測(cè)。
　?。ㄈ┭澧蛐湍z原C端肽(CTX-Ⅱ)水平采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)。
　?。ㄋ模┸浌墙M織形態(tài)學(xué)觀察
　　對(duì)各個(gè)組織切片行HE染色、番紅O染色和番紅O-固綠染色，并利用雙盲法對(duì)其進(jìn)行Mankin評(píng)分。
　?。ㄎ澹┸浌墙M織Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)
　　利用免疫組化方法，檢測(cè)各組小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織Ⅱ型膠原蛋白的表達(dá)，并利用ImageJ2x軟件

6、進(jìn)行平均灰度值測(cè)量。
　?。┸浌墙M織細(xì)胞凋亡情況
　　利用TUNEL法檢檢測(cè)軟骨組織細(xì)胞凋亡情況，計(jì)數(shù)各組織切片凋亡細(xì)胞數(shù)。
　　四、數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析
　　用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果用(x)± SE表示，方差分析方法進(jìn)行組間比較。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。
　　結(jié)果：
　　一、小鼠體重變化狀況
　　實(shí)驗(yàn)期間，各組小鼠一般狀況良好，生長(zhǎng)發(fā)育未見(jiàn)異常。高脂組小鼠體重高于對(duì)照組，

7、差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）;各干預(yù)組小鼠體重低于高脂組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　二、小鼠血清TG、TC水平
　　高脂組血清TG水平均高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);中劑量組血清TG水平低于高脂組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);高脂組血清TC水平均高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　三、小鼠血清CTX-Ⅱ水平
　　高脂組血清CTX-Ⅱ含量高于對(duì)照組，

8、差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);各干預(yù)組中，高劑量組血清CTX-Ⅱ含量低于高脂組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　四、小鼠軟骨組織形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)
　　HE染色下觀察，對(duì)照組軟骨細(xì)胞排列整齊，軟骨組織表面平整，軟骨組織基質(zhì)染色正常。高脂組軟骨細(xì)胞或減少或局部增加，且排列較為混亂，基質(zhì)染色不均勻。各干預(yù)組軟骨細(xì)胞偶有增生或減少，排列不規(guī)則，各干預(yù)組間比較無(wú)明顯差異。
　　對(duì)照組軟骨組織在番紅O染色下潮線界線較為清

9、晰、完整，無(wú)缺失現(xiàn)象。高脂組軟骨組織可見(jiàn)潮線缺失，顏色變淺等現(xiàn)象。干預(yù)各組偶見(jiàn)潮線缺失，各干預(yù)組間比較無(wú)明顯差異。
　　番紅O-固綠染色顯示對(duì)照組軟骨組織較為完整及寬厚，軟骨與骨之間分界較清。高脂組可見(jiàn)軟骨組織出現(xiàn)破損情況，有些組織也較為扁薄。各干預(yù)軟骨與骨之間界線清楚，偶有軟骨組織缺失，各干預(yù)組之間比較沒(méi)有明顯差異。
　　Mankin評(píng)分及發(fā)病率結(jié)果顯示高脂組均最高，與對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。干預(yù)組M

10、ankin評(píng)分及發(fā)病率與高脂組比較有不同程度下降，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　五、小鼠軟骨組織Ⅱ型膠原免疫組化染色結(jié)果
　　對(duì)照組軟骨細(xì)胞染色較深，基質(zhì)與細(xì)胞分界清晰。高脂組軟骨細(xì)胞明顯減少，染色較淺，基質(zhì)和細(xì)胞分界不清。各干預(yù)組軟骨細(xì)胞染色較為清晰。與對(duì)照組比較，高脂組平均灰度值較低，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。干預(yù)各組與高脂組比較，平均灰度值均有不同程度升高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　

11、　六、小鼠關(guān)節(jié)軟骨組織細(xì)胞凋亡情況
　　高脂組與對(duì)照組比較，軟骨組織中的黃綠色顆粒多于對(duì)照組，在軟骨組織各個(gè)分層中都有分布。高脂組細(xì)胞凋亡率高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。各干預(yù)組與高脂組比較，軟骨組織中的黃綠色顆粒有不同程度減少，其中以中劑量最為明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.利用高脂飲食可以誘導(dǎo)C57BL/6J小鼠發(fā)生OA。
　　2.RES可以抑制高脂飲食誘導(dǎo)的