胰島素干預(yù)對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的C57BL-6糖尿病小鼠脂肪肝的影響.pdf

1、2型糖尿病是復(fù)雜的基因遺傳背景與現(xiàn)代生活方式(能量攝入過多及體力活動(dòng)減少)共同作用而導(dǎo)致胰島素作用障礙(胰島素抵抗)和胰島素分泌相對(duì)缺陷。胰島素抵抗與非酒精性脂肪肝(NAFLD)關(guān)系密切，在2型糖尿病患者中NAFLD發(fā)病率高達(dá)50-75％。2型糖尿病是NAFLD患者發(fā)生肝纖維化的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，其纖維化進(jìn)展更加迅速，并顯著增加死亡率。一項(xiàng)日本的研究，在空腹血糖正常人群的NAFLD患病率達(dá)27％，空腹血糖受損的患者達(dá)43％，而在新診斷的2型

2、糖尿病患者高達(dá)62％。因此，在初診的糖尿病中，積極治療非酒精性脂肪肝顯得尤其重要。 胰島素是已知最重要的代謝調(diào)節(jié)激素，能快速有效地調(diào)節(jié)搪、脂代謝。此外，胰島素還有促生長、增殖、分化的功能和促進(jìn)脂肪合成的作用。英國前瞻性糖尿病研究(UKPDS)表明使用胰島素進(jìn)行嚴(yán)格的血糖控制顯著增加循環(huán)中胰島素濃度，加劇了2型糖尿病患者的高胰島素血癥。Anderwald等給2型糖尿病患者分別輸注胰島素12小時(shí)或67小時(shí)，發(fā)現(xiàn)肝臟及肌肉脂肪合成是增

3、加的，而全身的胰島素敏感性并未改變。國內(nèi)也有學(xué)者的研究發(fā)現(xiàn)外源性胰島素能促進(jìn)SD糖尿病大鼠肝臟的脂肪沉積。因此，用胰島素治療2型糖尿病，在降低血糖、調(diào)節(jié)血脂的同時(shí)，是否加重高胰島素血癥？在高胰島素血癥的背景下是否加重肝臟的脂肪沉積？這一顧慮成為早期使用胰島素治療2型糖尿病的障礙。目前的治療模式是，直到多種口服降糖藥聯(lián)合作用失效才使用外源性胰島素。 但是，近年的臨床研究使人們對(duì)早期胰島素治療的價(jià)值有新的認(rèn)識(shí)。我們及國外的學(xué)者的研究

4、發(fā)現(xiàn)：對(duì)早期診斷的2型糖尿病患者使用胰島素治療，除了快速解除高血糖等代謝紊亂、相當(dāng)程度上改善胰島β細(xì)胞功能，還減輕了整體的胰島素抵抗。這種治療收益可能對(duì)改善2型糖尿病的預(yù)后、延緩疾病的進(jìn)展、治療與胰島素抵抗密切相關(guān)的疾病帶來好處。這一新的臨床發(fā)現(xiàn)對(duì)早期胰島素治療的利與弊提出了新的挑戰(zhàn)。最近的臨床研究提示6個(gè)月的基礎(chǔ)胰島素治療達(dá)到良好血糖控制的同時(shí)，改善了肝臟胰島素的敏感性和減輕了肝臟的脂肪沉積。這一結(jié)果提示早期的胰島素干預(yù)可能對(duì)2型糖尿

5、病患者的非酒精性脂肪肝的治療有利。但其具體機(jī)制不清楚？ 由于肝臟在機(jī)體的糖、脂代謝調(diào)節(jié)中起重要作用，肝臟胰島素抵抗在2型糖尿病和非酒精性脂肪肝的發(fā)生機(jī)制中起重要作用，肝臟的胰島素抵抗也是2型糖尿病和非酒精性脂肪肝治療的重要靶點(diǎn)。我們擬借助理想的2型糖尿病伴脂肪肝的動(dòng)物模型，深入研究早期胰島素治療對(duì)肝臟的胰島素信號(hào)通路和脂肪的沉積的影響以及其可能機(jī)制。 第一章2型糖尿病伴非酒精性脂肪肝模型的建立.高脂飲食誘導(dǎo)C57BL/6

6、小鼠的代謝異常和肝臟表現(xiàn) 一、研究目的: 建立類似人類2型糖尿病伴有非酒精性脂肪肝病理生理特點(diǎn)的動(dòng)物模型。 二、研究方法: 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 雄性C57BL/6小鼠30只，5周齡，分為A、B、C組，每組10只。A組給予普通標(biāo)準(zhǔn)小鼠飼料，B組、C組給予高脂飼料喂養(yǎng)。 2.飼料配制: 普通標(biāo)準(zhǔn)小鼠飼料脂肪含為4.43g/100g，供熱百分比脂肪9.9％，碳水化合物63.93％，蛋白質(zhì)

7、26.18％。高脂飼料脂肪含量占38.2g/100g，供熱百分比脂肪60％(脂肪主要來自豬油)，碳水化合物28.21％，蛋白質(zhì)11.9％。 3.評(píng)估指標(biāo): (1)體重 (2)非空腹血糖(3)經(jīng)腹葡萄糖耐量試驗(yàn)(IPGTT) (4)血脂：游離脂肪酸(FFA)甘油三酯(TG)和總膽固醇(TC) (5)肝臟的脂肪含量和病理 三、結(jié)果: (1)高脂飲食組小鼠體重顯著高于對(duì)照組，呈現(xiàn)明顯腹型

8、肥胖。 (2)高脂飲食組小鼠非空腹血糖及經(jīng)腹葡萄糖耐量試驗(yàn)的各觀察點(diǎn)血糖均顯著高于對(duì)照組。且高脂飲食組小鼠血糖高峰延遲至注射葡萄糖后30分鐘。 (3)高脂飲食組小鼠的FFA及TC均高于對(duì)照組.兩組間的TC水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，F(xiàn)FA有升高趨勢(shì)。TG水平在兩組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 (4)高脂飲食組小鼠肝臟的TG含量顯著高于對(duì)照組，肝臟HE染色顯示全小葉肝細(xì)胞排列紊亂，大多數(shù)肝細(xì)胞胞質(zhì)充滿脂滴，呈顯為大小不等空泡樣變性，中度

9、脂肪變性。 四、結(jié)論: 我們成功地以高脂肪含量的飲食誘導(dǎo)C57BL/6小鼠發(fā)生肥胖、糖調(diào)節(jié)受損、顯著的肝臟脂肪沉積。該模型類似人類2型糖尿病伴有非酒精性脂肪肝的特點(diǎn)?？勺鳛?型糖尿病和非酒精性脂肪肝發(fā)病機(jī)理研究和治療機(jī)制研究的天然理想模型。 第二章胰島素干預(yù)對(duì)C57BL/6糖尿病伴非酒精性脂肪肝小鼠肝臟胰島素信號(hào)通路和脂肪沉積的影響 一、研究目的: 通過westernblotting等分子生物醫(yī)學(xué)

10、技術(shù)研究胰島素干預(yù)對(duì)肝臟脂肪沉積、糖脂代謝功能及胰島素信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用。 二、研究方法: 1.胰島素干預(yù)：高脂喂養(yǎng)12周的C57BL/6小鼠給予甘精胰島素干預(yù)4周。 2.測定血脂和肝臟的脂肪含量。 3.提取肝臟組織總RNA，用于RT—PCR；測定肝臟胰島素糖脂代謝信號(hào)通路基因的差異表達(dá)。 4.提取肝臟組織的胞漿蛋白和核蛋白，用于westernblotting；測定肝臟胰島素糖脂代謝信號(hào)通路蛋白的

11、差異表達(dá)。 三、結(jié)果: 1.胰島素干預(yù)組的空腹血糖和IPGIT所有觀察點(diǎn)的血糖均較高脂飲食組顯著改善。 2.血脂水平：胰島素干預(yù)組的血漿TC、FFA比高脂飲食組顯著降低，干預(yù)組的TG比高脂飲食組有下降趨勢(shì)。 3.肝臟脂肪含量：胰島素干預(yù)組小鼠肝臟的TG比高脂飲食組顯著降低，TG顯著降低達(dá)20.71％，TC變化不明顯。 4.肝臟HE染色：胰島素干預(yù)組小鼠肝臟空泡樣變性明顯減少，細(xì)胞內(nèi)僅可見少許小泡性

12、脂肪滴。 5.基因、蛋白的變化：高脂飲食組肝臟調(diào)控糖異生的G6Pas、PEPCK蛋白和調(diào)控脂代謝的SREBP-1、SREBP—2蛋白、SREBP-1c、FASmRNA的表達(dá)顯著升高；炎癥分子TNF—a蛋白顯著升高；IRS—2蛋白的表達(dá)顯著下調(diào)。胰島素治療下調(diào)了肝臟TNF—a、SREBP-1蛋白和SREBP-1c、FASmRNA的表達(dá)；抑制調(diào)控糖異生的G6Pas、PEPCK的表達(dá)；上調(diào)肝臟IRS—2的表達(dá)，SREBP—2無明顯變化