三種骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植方法對大鼠急性皮膚創(chuàng)面愈合作用的比較研究.pdf

1、急性皮膚創(chuàng)傷是非常常見的創(chuàng)傷，幾乎見于所有外科創(chuàng)傷中，包括燒傷和輻射傷等。是由于正常皮膚受到外來因素的不良作用而產(chǎn)生破損，暴露真皮或真皮下層組織造成的。在此類創(chuàng)傷處理中，首要任務(wù)是有效覆蓋創(chuàng)面，既要防止感染，又要防止組織液和血液滲出，同時還不引起機(jī)體的不良反應(yīng)，為后續(xù)治療和創(chuàng)面愈合創(chuàng)造良好環(huán)境。然而，普通覆蓋物往往以人造材料為主，生物相容性較低，幾乎不具備促進(jìn)皮膚細(xì)胞增殖和愈合的能力，越來越難以滿足愈合快速、美觀的要求，特別是頜面部血管

2、豐富皮膚的特殊美觀要求。自體植皮手術(shù)不僅給患者造成二次創(chuàng)傷，同時也受限于患者自身?xiàng)l件。因此，找到一種有效促進(jìn)皮膚愈合，達(dá)到美觀功能要求的材料對于治療皮膚創(chuàng)傷，特別是頜面部皮膚創(chuàng)傷，具有重要價值。
　　骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells, BMMSCs），是一種源于中胚層并具有自我更新和多向分化潛能的成體干細(xì)胞，存在于成年動物的骨髓基質(zhì)中，能夠被分離培養(yǎng)并形成克隆。BMMSCs以其

3、低抗原性、多向分化和分泌多種促血管新生因子與免疫調(diào)節(jié)因子的獨(dú)特性能，在組織修復(fù)、器官移植和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域已有廣泛應(yīng)用。目前，主要應(yīng)用途徑包括靜脈注射和在損傷部位周圍局部注射BMMSCs，分別利用血液輸送和趨化過程使BMMSCs到達(dá)創(chuàng)傷部位發(fā)揮修復(fù)作用。BMMSCs在某些炎性刺激后能分泌抑制過度炎癥的因子和促血管化、成纖維細(xì)胞生長遷移的因子被認(rèn)為是其促進(jìn)創(chuàng)傷愈合的主要機(jī)制。
　　細(xì)胞膜片技術(shù)是近年來出現(xiàn)的，以不使用胰酶消化而獲得大量可

4、供移植的細(xì)胞為特點(diǎn)的技術(shù)。細(xì)胞在特殊培養(yǎng)基誘導(dǎo)下依靠自身分泌的細(xì)胞外基質(zhì)相連接成片狀，并可用機(jī)械力或應(yīng)用熱敏材料將其從固相表面剝離。這為BMMSCs等一類擁有優(yōu)良性質(zhì)的細(xì)胞提供了一種全新的移植方式，避免了酶消化帶來的細(xì)胞損失，使得移植細(xì)胞的性質(zhì)能夠最大限度的保留和發(fā)揮。目前，BMMSCs膜片已在骨折修復(fù)、牙周膜修復(fù)等多個領(lǐng)域成功應(yīng)用，但用于皮膚損傷修復(fù)卻未見報道。本實(shí)驗(yàn)采用大鼠來源的BMMSCs體外培養(yǎng)，經(jīng)鑒定后構(gòu)建BMMSCs膜片，旨

5、在驗(yàn)證BMMSCs膜片移植與細(xì)胞懸液注射法在修復(fù)典型的全層皮膚損傷時，修復(fù)效果和具體機(jī)制上的區(qū)別，進(jìn)而歸納出發(fā)揮BMMSCs促愈合功能的最佳途徑，為今后臨床上應(yīng)用BMMSCs修復(fù)皮膚急性損傷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　研究目的:
　?。?）驗(yàn)證體外穩(wěn)定構(gòu)建SD大鼠BMMSCs膜片的方法，并探討B(tài)MMSCs膜片（BMMSCs-sheet）的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)和分泌細(xì)胞外因子時的特殊性質(zhì)；
　?。?）構(gòu)建大鼠背部急性全層皮膚創(chuàng)傷模型，并采

6、用細(xì)胞膜片（BMMSCs-sheet, B-sheet）、靜脈注射（intravenous-injection, int-in）和創(chuàng)面周圍局部注射BMMSCs（local-injection, loc-in）三種方式移植BMMSCs，探討和比較三組模型的創(chuàng)面愈合情況、血管化情況、和炎癥情況；
　?。?）比較三種移植方式的細(xì)胞在創(chuàng)面存活及對炎癥狀況的影響，探討B(tài)MMSCs-sheet促進(jìn)創(chuàng)傷愈合的主要機(jī)制。
　　研究方法:

7、r>　?。?）采用全骨髓培養(yǎng)法分離培養(yǎng)熒光SD大鼠（GFP-SD Rats）骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（GFP-BMMSCs）。并用流式細(xì)胞技術(shù)鑒定表面分子、繪制生長曲線、誘導(dǎo)多向分化等方式進(jìn)行干細(xì)胞特性驗(yàn)證。
　?。?）采用手術(shù)剪除的方法建立普通大鼠背部全層皮膚創(chuàng)傷模型，并將模型分為三組，分別移植成功培養(yǎng)的GFP-BMMSCs-sheet，尾靜脈注射以及創(chuàng)面局部注射相同細(xì)胞量的GFP-BMMSCs。同時在每一組設(shè)置陰性對照。
　?。?/p>

8、3）分別在不同時間點(diǎn)（1,2,4,6-week）取材，收集創(chuàng)面愈合大小和血管化的直觀形態(tài)學(xué)資料。
　?。?）對創(chuàng)面組織切面后進(jìn)行蘇木精–伊紅（HE）和馬森三色染色，收集不同移植組創(chuàng)面組織炎癥狀況、真皮改建和膠原積累狀況、附屬器發(fā)育狀況等并量化對比。
　?。?）采用免疫熒光染色檢測創(chuàng)面存活的GFP-BMMSCs和免疫細(xì)胞，并量化數(shù)據(jù)，找出相互關(guān)聯(lián)。
　　（6）提取創(chuàng)面新生組織的RNA，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行RT-PCR，對比不同移

9、植組見相關(guān)炎性因子、促血管新生因子、免疫調(diào)節(jié)因子和膠原蛋白等表達(dá)情況。
　　研究結(jié)果：
　?。?）分離培養(yǎng)的GFP-BMMSCs表達(dá)正常的間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志，不表達(dá)造血系統(tǒng)來源細(xì)胞表面標(biāo)志，并具有克隆形成能力。茜素紅、油紅染色顯示所培養(yǎng)的BMMSCs能夠被誘導(dǎo)向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞方向分化。傳代后GFP-BMMSCs在熒光顯微鏡下有明顯熒光。
　?。?）成功大鼠背部全層皮膚創(chuàng)傷模型，大鼠正常存活，無全身性不良反應(yīng)和嚴(yán)重

10、感染發(fā)生。
　?。?）三種移植方法在愈合的1周和2周時（炎癥反應(yīng)期和增殖-遷移-收縮期）創(chuàng)面面積無明顯差異。但在4周時三組創(chuàng)面面積顯著小于各自對照組；B-sheet組創(chuàng)面面積明顯小于int-in和loc-in兩組，后兩組間無顯著差異；各對照組間也無明顯差異。4周時，B-sheet組大鼠愈合皮膚血管化程度顯著高于其他兩組，后兩組間無顯著差異，對照組間無差異。
　?。?） HE染色和馬森染色顯示B-sheet組愈合皮膚組織4周炎

11、癥細(xì)胞浸潤狀況低于int-in和loc-in組，規(guī)則膠原積累程度和膠原密度均高于后兩組。
　?。?）移植后4周，B-sheet組新生組織中表達(dá)GFP的細(xì)胞存活量顯著高于int-in組和loc-in組，同時CD68陽性細(xì)胞數(shù)也多于后兩組，CD45陽性細(xì)胞數(shù)則顯著低于后兩組。移植后4周，B-sheet組新生組織中炎性因子表達(dá)量顯著低于int-in組和loc-in組以及對照組，促成纖維細(xì)胞生長因子和粗血管新生因子顯著高于量注射組及對照組

12、。
　　研究結(jié)論：
　　（1）體外培養(yǎng)的大鼠BMMSCs可在誘導(dǎo)下形成細(xì)胞膜片，膜片有一定的強(qiáng)度和韌性，并能用機(jī)械力刮下。
　?。?） BMMSCs-sheet表達(dá)多種促進(jìn)愈合的細(xì)胞因子和蛋白。移植全層皮膚創(chuàng)面后，BMMSCs-sheet能促進(jìn)創(chuàng)面愈合及血管化，效果優(yōu)于靜脈注射和創(chuàng)面局部注射。
　?。?） BMMSCs-sheet能降低創(chuàng)傷后炎癥反應(yīng)強(qiáng)度，促進(jìn)真皮基質(zhì)較快較規(guī)則的沉積，效果優(yōu)于靜脈注射和創(chuàng)面局部注