雙環(huán)醇對(duì)次黃嘌呤脫氫酶Ⅱ的作用及其抗炎機(jī)制研究.pdf

1、第一部分、雙環(huán)醇對(duì)次黃嘌呤脫氫酶Ⅱ的作用
　　雙環(huán)醇是中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物所研發(fā)的、具有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的抗炎保肝藥物，自2001年起，已在臨床廣泛應(yīng)用至今。但其作用機(jī)制與靶點(diǎn)不明部分限制了臨床應(yīng)用。本論文目的是探索雙環(huán)醇的潛在抗炎機(jī)制及靶點(diǎn)。前期利用中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所TarFisDock網(wǎng)絡(luò)反式分子對(duì)接系統(tǒng)對(duì)雙環(huán)醇與PDTD數(shù)據(jù)庫(kù)中的蛋白質(zhì)進(jìn)行虛擬分子對(duì)接，發(fā)現(xiàn)次黃嘌呤脫氫酶Ⅱ(inosine5'-monophosphate

2、dehydrogenaseⅡ，IMPDHⅡ)與雙環(huán)醇潛在結(jié)合能力最強(qiáng)。為考察IMPDHⅡ是否為雙環(huán)醇作用靶點(diǎn)，本部分論文首先采用小鼠原代脾淋巴細(xì)胞增殖模型、人外周血單個(gè)核細(xì)胞(human peripheral blood monouclear cells，hPBMC)增殖模型及IMPDHⅡ酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型，考察雙環(huán)醇對(duì)IMPDHⅡ酶活性的影響。結(jié)果顯示1μM、5μM的雙環(huán)醇能顯著抑制5μg/mL concanavalinA(conA)

3、刺激的小鼠原代脾淋巴細(xì)胞增殖;雙環(huán)醇對(duì)5μg/mL phytohemagglutinin(PHA)刺激的人外周血單個(gè)核細(xì)胞增殖有抑制的趨勢(shì)（僅兩次實(shí)驗(yàn)）;在IMPDHⅡ酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型中，低濃度雙環(huán)醇（0.1μM，0.5μM，1μM，5μM，10μM）具有促進(jìn)IMPDHⅡ酶活的趨勢(shì)，而高濃度雙環(huán)醇（50μM，100μM，200μM）具有抑制IMPDHⅡ酶活性的趨勢(shì)，但均不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上結(jié)果提示雙環(huán)醇并不是傳統(tǒng)意義的IMPDHⅡ酶活

4、性抑制劑。進(jìn)一步考察雙環(huán)醇對(duì)IMPDHⅡ生物學(xué)功能的影響。結(jié)果顯示，雙環(huán)醇可促進(jìn)活化的TLR2受體對(duì)IMPDHⅡ的募集作用，募集IMPDHⅡ的TLR2無(wú)法向下游傳遞炎癥信號(hào)，繼而抑制下游NF-κB通路的激活與細(xì)胞炎癥因子TNF-α、IL-1β的釋放。這可能為雙環(huán)醇抗炎機(jī)制之一。
　　第二部分、雙環(huán)醇對(duì)pam3刺激巨噬細(xì)胞TLR2信號(hào)傳導(dǎo)通路的影響及機(jī)制
　　論文第一部分工作顯示，在單核細(xì)胞，雙環(huán)醇能夠通過(guò)促進(jìn)IMPDHⅡ進(jìn)入

5、脂閥，與活化的TLR2結(jié)合，進(jìn)而影響TLR2下游炎癥通路，減少炎癥因子的釋放，發(fā)揮抗炎活性。在本部分實(shí)驗(yàn)中，利用組織中的免疫細(xì)胞——巨噬細(xì)胞進(jìn)一步考察雙環(huán)醇的抗炎作用及機(jī)制。鑒于近年來(lái)雙環(huán)醇在非酒精性脂肪肝治療中療效良好，我們也同時(shí)考察了雙環(huán)醇對(duì)同時(shí)參與炎癥及代謝作用的代謝性核受體表達(dá)的影響。50ng/mL佛波酯(phorbol myristate acetate，PMA)作用人單核細(xì)胞THP-1細(xì)胞2天，該細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞。利用30

6、0ng/mL pam3刺激THP-1巨噬細(xì)胞6h以激活TLR2受體，同時(shí)考察雙環(huán)醇的作用。ELISA結(jié)果顯示，5、10、50μM雙環(huán)醇對(duì)pam3刺激的巨噬細(xì)胞炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-Iβ釋放均表現(xiàn)出良好的抑制活性。Western結(jié)果顯示，在pam3刺激TLR2活化的NF-κB經(jīng)典通路中，雙環(huán)醇可顯著降低NF-κB通路上游PI3K的表達(dá)，抑制AKT、IKK的磷酸化水平，進(jìn)而降低IκB蛋白的磷酸化，減少IκB的降解，抑制NF-κ

7、B入核，減少炎癥因子的釋放。對(duì)于在炎癥及代謝中均發(fā)揮重要作用的代謝性核受體PPARγ、LXRα與RXRα，雙環(huán)醇對(duì)PPARγ表現(xiàn)出劑量依賴性的激活作用。
　　第三部分、雙環(huán)醇對(duì)LPS刺激巨噬細(xì)胞TLR4信號(hào)傳導(dǎo)通路的影響及機(jī)制
　　在本論文第三部分工作中，利用經(jīng)典的免疫激活劑脂多糖(LPS)刺激TLR4受體激活人THP-1巨噬細(xì)胞，進(jìn)一步考察雙環(huán)醇對(duì)LPS/TLR4引起炎癥反應(yīng)的作用及機(jī)制。同時(shí)分析與pam3/TLR2通路的

8、異同。ELISA結(jié)果顯示，雙環(huán)醇對(duì)LPS/TLR4引起的巨噬細(xì)胞炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6釋放亦有顯著抑制活性，但雙環(huán)醇對(duì)TLR4表達(dá)，Akt、IKK磷酸化均無(wú)明顯影響，卻能抑制PI3K的表達(dá)，顯著促進(jìn)IκB，抑制IκB磷酸化，進(jìn)而抑制NF-κB入核。進(jìn)一步的western結(jié)果顯示:雙環(huán)醇對(duì)未受刺激及受刺激的巨噬細(xì)胞均顯著上調(diào)PPARγ的表達(dá)。利用siRNA技術(shù)對(duì)PPARγ進(jìn)行干擾后，western結(jié)果顯示，雙環(huán)醇仍能夠上