雙環(huán)醇對次黃嘌呤脫氫酶Ⅱ的作用及其抗炎機制研究.pdf

1、第一部分、雙環(huán)醇對次黃嘌呤脫氫酶Ⅱ的作用
　　雙環(huán)醇是中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物所研發(fā)的、具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)的抗炎保肝藥物，自2001年起，已在臨床廣泛應(yīng)用至今。但其作用機制與靶點不明部分限制了臨床應(yīng)用。本論文目的是探索雙環(huán)醇的潛在抗炎機制及靶點。前期利用中國科學(xué)院上海藥物研究所TarFisDock網(wǎng)絡(luò)反式分子對接系統(tǒng)對雙環(huán)醇與PDTD數(shù)據(jù)庫中的蛋白質(zhì)進行虛擬分子對接，發(fā)現(xiàn)次黃嘌呤脫氫酶Ⅱ(inosine5'-monophosphate

2、dehydrogenaseⅡ，IMPDHⅡ)與雙環(huán)醇潛在結(jié)合能力最強。為考察IMPDHⅡ是否為雙環(huán)醇作用靶點，本部分論文首先采用小鼠原代脾淋巴細胞增殖模型、人外周血單個核細胞(human peripheral blood monouclear cells，hPBMC)增殖模型及IMPDHⅡ酶促反應(yīng)動力學(xué)模型，考察雙環(huán)醇對IMPDHⅡ酶活性的影響。結(jié)果顯示1μM、5μM的雙環(huán)醇能顯著抑制5μg/mL concanavalinA(conA)

3、刺激的小鼠原代脾淋巴細胞增殖;雙環(huán)醇對5μg/mL phytohemagglutinin(PHA)刺激的人外周血單個核細胞增殖有抑制的趨勢（僅兩次實驗）;在IMPDHⅡ酶促反應(yīng)動力學(xué)模型中，低濃度雙環(huán)醇（0.1μM，0.5μM，1μM，5μM，10μM）具有促進IMPDHⅡ酶活的趨勢，而高濃度雙環(huán)醇（50μM，100μM，200μM）具有抑制IMPDHⅡ酶活性的趨勢，但均不具統(tǒng)計學(xué)意義。以上結(jié)果提示雙環(huán)醇并不是傳統(tǒng)意義的IMPDHⅡ酶活

4、性抑制劑。進一步考察雙環(huán)醇對IMPDHⅡ生物學(xué)功能的影響。結(jié)果顯示，雙環(huán)醇可促進活化的TLR2受體對IMPDHⅡ的募集作用，募集IMPDHⅡ的TLR2無法向下游傳遞炎癥信號，繼而抑制下游NF-κB通路的激活與細胞炎癥因子TNF-α、IL-1β的釋放。這可能為雙環(huán)醇抗炎機制之一。
　　第二部分、雙環(huán)醇對pam3刺激巨噬細胞TLR2信號傳導(dǎo)通路的影響及機制
　　論文第一部分工作顯示，在單核細胞，雙環(huán)醇能夠通過促進IMPDHⅡ進入

5、脂閥，與活化的TLR2結(jié)合，進而影響TLR2下游炎癥通路，減少炎癥因子的釋放，發(fā)揮抗炎活性。在本部分實驗中，利用組織中的免疫細胞——巨噬細胞進一步考察雙環(huán)醇的抗炎作用及機制。鑒于近年來雙環(huán)醇在非酒精性脂肪肝治療中療效良好，我們也同時考察了雙環(huán)醇對同時參與炎癥及代謝作用的代謝性核受體表達的影響。50ng/mL佛波酯(phorbol myristate acetate，PMA)作用人單核細胞THP-1細胞2天，該細胞分化為巨噬細胞。利用30

6、0ng/mL pam3刺激THP-1巨噬細胞6h以激活TLR2受體，同時考察雙環(huán)醇的作用。ELISA結(jié)果顯示，5、10、50μM雙環(huán)醇對pam3刺激的巨噬細胞炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-Iβ釋放均表現(xiàn)出良好的抑制活性。Western結(jié)果顯示，在pam3刺激TLR2活化的NF-κB經(jīng)典通路中，雙環(huán)醇可顯著降低NF-κB通路上游PI3K的表達，抑制AKT、IKK的磷酸化水平，進而降低IκB蛋白的磷酸化，減少IκB的降解，抑制NF-κ

7、B入核，減少炎癥因子的釋放。對于在炎癥及代謝中均發(fā)揮重要作用的代謝性核受體PPARγ、LXRα與RXRα，雙環(huán)醇對PPARγ表現(xiàn)出劑量依賴性的激活作用。
　　第三部分、雙環(huán)醇對LPS刺激巨噬細胞TLR4信號傳導(dǎo)通路的影響及機制
　　在本論文第三部分工作中，利用經(jīng)典的免疫激活劑脂多糖(LPS)刺激TLR4受體激活人THP-1巨噬細胞，進一步考察雙環(huán)醇對LPS/TLR4引起炎癥反應(yīng)的作用及機制。同時分析與pam3/TLR2通路的

8、異同。ELISA結(jié)果顯示，雙環(huán)醇對LPS/TLR4引起的巨噬細胞炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6釋放亦有顯著抑制活性，但雙環(huán)醇對TLR4表達，Akt、IKK磷酸化均無明顯影響，卻能抑制PI3K的表達，顯著促進IκB，抑制IκB磷酸化，進而抑制NF-κB入核。進一步的western結(jié)果顯示:雙環(huán)醇對未受刺激及受刺激的巨噬細胞均顯著上調(diào)PPARγ的表達。利用siRNA技術(shù)對PPARγ進行干擾后，western結(jié)果顯示，雙環(huán)醇仍能夠上