桑色素對(duì)酪氨酸酶、黃嘌呤氧化酶抑制機(jī)理的探討.pdf

1、一直以來(lái)，人體皮膚病如黃褐斑、老年斑、妊娠斑等都是十分困擾人們的常見(jiàn)疾病，所以，美白祛斑化妝品和美白食品的研究受到廣泛關(guān)注和發(fā)展。痛風(fēng)(一種由過(guò)高的尿酸引起的疾病)已被聯(lián)合國(guó)列為21世紀(jì)20大頑癥之一，而且隨著生活水平的提高、生活節(jié)奏的加快和人們的飲食結(jié)構(gòu)的不合理，我國(guó)痛風(fēng)的發(fā)病率逐年上升，現(xiàn)已高于世界平均水平。據(jù)報(bào)道，在人體中，酪氨酸酶主要是催化機(jī)體生成黑色素，其過(guò)量表達(dá)會(huì)使黑色素聚集，從而導(dǎo)致皮膚病的產(chǎn)生，所以，抑制酪氨酸酶的活性是

2、祛斑美白的重要手段；黃嘌呤氧化酶是人體內(nèi)產(chǎn)生尿酸過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵性酶，是產(chǎn)生痛風(fēng)的重要因素，因此，將黃嘌呤氧化酶作為藥物的作用靶點(diǎn)，抑制其活性也是臨床治療痛風(fēng)的主要途徑。
　　近年來(lái)，科學(xué)工作者在祛斑和抗痛風(fēng)藥物合成、研發(fā)方面取得了一定的成果，然而，這些合成藥物大部分具有一定的副作用，這在一定程度上限制了它們的應(yīng)用。黃酮類(lèi)化合物以其廣泛的生物活性受到了人們的青睞，從植物黃酮類(lèi)化合物中尋找和篩選有效的酪氨酸酶和黃嘌呤氧化酶抑制劑，進(jìn)

3、而為祛斑和痛風(fēng)病治療提供新的藥物選擇已受到科技工作者的普遍關(guān)注。本文分別以酪氨酸酶和黃嘌呤氧化酶作為靶點(diǎn)，運(yùn)用多種現(xiàn)代分析技術(shù)如抑制動(dòng)力學(xué)技術(shù)、熒光光譜技術(shù)、圓二色譜技術(shù)等，并結(jié)合分子模擬手段研究了常見(jiàn)黃酮類(lèi)化合物桑色素對(duì)上述兩種酶的抑制動(dòng)力學(xué)和抑制機(jī)理，以期為桑色素在化妝品和抗痛風(fēng)藥物方面的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)，也為研究其它活性組分對(duì)酶的抑制作用提供方法借鑒和技術(shù)支持。
　　本文的主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下：
　　1.簡(jiǎn)要介紹

4、了酪氨酸酶和黃嘌呤氧化酶的結(jié)構(gòu)、催化功能和生理特性；概述酪氨酸酶抑制劑和黃嘌呤氧化酶抑制劑的研究進(jìn)展。
　　2.以酪氨酸酶為靶點(diǎn)，采用抑制動(dòng)力學(xué)方法、熒光光譜法和圓二色譜法，在pH6.8的磷酸鹽緩沖體系中，研究了室溫條件下桑色素對(duì)酪氨酸酶的抑制機(jī)制。抑制動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果表明，桑色素通過(guò)多相動(dòng)力學(xué)過(guò)程可逆地與酶催化底物左旋多巴(L-DOPA)競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合到酪氨酸酶的活性中心，其半數(shù)抑制濃度IC50和抑制常數(shù)Ki分別為(8.13±1.2

5、1)×10-5L/mol、(7.32±0.36)×10-5L/mol，桑色素顯示較強(qiáng)的酪氨酸酶抑制活性。熒光光譜法研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，桑色素主要通過(guò)氫鍵和范德華力結(jié)合到酪氨酸酶上的一個(gè)特定位置，形成基態(tài)復(fù)合物，從而靜態(tài)地猝滅酪氨酸酶的內(nèi)源熒光，在298K溫度下的結(jié)合常數(shù)為8.10×104L/mol。兩者之間可能發(fā)生了非輻射能量轉(zhuǎn)移，結(jié)合距離為5.12nm。圓二色譜分析顯示，桑色素的存在誘導(dǎo)了酪氨酸酶的β-折疊含量增加，α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)

6、則轉(zhuǎn)曲的含量降低。分子模擬結(jié)果直觀地展現(xiàn)出桑色素與酪氨酸酶的結(jié)合區(qū)域與結(jié)合模式，桑色素插入到酪氨酸酶的活性中心，與其周?chē)囊恍┌被釟埢鵋is85、His94、His244、His259、Asn260、His263、Phe264、Met280、Gly281、Val283和His296等發(fā)生相互作用，并且形成了兩個(gè)氫鍵。推測(cè)桑色素對(duì)酪氨酸酶的抑制機(jī)理可能是桑色素插入到酪氨酸酶的活性位點(diǎn)，不但占據(jù)了酪氨酸酶對(duì)底物L(fēng)-DOPA的催化中心，阻礙

7、了底物的進(jìn)入，而且還誘導(dǎo)了酪氨酸酶構(gòu)象的變化，直接導(dǎo)致酪氨酸酶的活性降低。
　　3.在pH7.5的磷酸鹽緩沖液體系中，測(cè)定了桑色素對(duì)黃嘌呤氧化酶的抑制率和抑制類(lèi)型，研究了桑色素與黃嘌呤氧化酶的結(jié)合特性，桑色素對(duì)黃嘌呤氧化酶構(gòu)象的影響以及山奈酚對(duì)桑色素抑制黃嘌呤氧化酶活性的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，桑色素是一種較強(qiáng)的、可逆的混合型黃嘌呤氧化酶抑制劑，其IC50為1.35×10–5mol/L，抑制常數(shù)Ki和抑制系數(shù)α分別為1.21×10-5

8、mol/L和1.94；桑色素在黃嘌呤氧化酶有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，在298K時(shí)的結(jié)合常數(shù)Ka為3.22×104L/mol，該結(jié)合過(guò)程是一個(gè)吸熱和熵驅(qū)動(dòng)過(guò)程，疏水作用力是其作用的主要驅(qū)動(dòng)力。分子對(duì)接發(fā)現(xiàn)，桑色素分子進(jìn)入黃嘌呤氧化酶的疏水空腔，與活性中心(含Mo區(qū)域)周?chē)囊恍┲饕被釟埢鵖er1075、Pro076、Asn768、Lys771、Leu648和Leu1014等發(fā)生作用。圓二色譜分析表明，桑色素與黃嘌呤氧化酶作用誘導(dǎo)了酶二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生

9、改變。桑色素抑制黃嘌呤氧化酶的活性可能一方面是由于桑色素結(jié)合到酶的疏水空腔中，占據(jù)了底物進(jìn)入活性中心的通道，從而降低了黃嘌呤氧化酶對(duì)底物的催化速率；另一方面是由于桑色素結(jié)合到XO上，誘導(dǎo)XO的結(jié)構(gòu)更加緊湊而不利于其活性中心暴露于反應(yīng)環(huán)境中，從而降低了XO與底物的接觸。另外，研究發(fā)現(xiàn)，在桑色素濃度為2.0×10-6mol/L、山奈酚濃度為2.0×10-6或8.0×10-6mol/L，和桑色素濃度為1.4×10-5mol/L、山奈酚濃度為8

10、.0×10-6mol/L時(shí)，它們對(duì)黃嘌呤氧化酶具有良好的協(xié)同抑制效應(yīng)，這可能是因?yàn)樗鼈儾粌H占據(jù)了XO的活性中心，還占據(jù)了底物進(jìn)入XO活性中心的通道，并且同時(shí)對(duì)XO的構(gòu)象產(chǎn)生影響。
　　4.采用多種光譜方法結(jié)合分子模擬技術(shù)，研究了山奈酚對(duì)黃嘌呤氧化酶的抑制機(jī)理和木犀草素對(duì)山奈酚抑制黃嘌呤氧化酶活性的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，山奈酚是一種有效的可逆性黃嘌呤氧化酶抑制劑，能夠與底物黃嘌呤競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合到黃嘌呤氧化酶的活性位點(diǎn)，其IC50和Ki分

11、別為(2.18±0.02)×10-6mol/L和(6.77±1.02)×10-6mol/L。山奈酚通過(guò)靜態(tài)猝滅過(guò)程與黃嘌呤氧化酶形成基態(tài)復(fù)合物，疏水作用是主要驅(qū)動(dòng)力。山奈酚引起黃嘌呤氧化酶中酪氨酸和色氨酸殘基所處微環(huán)境的極性增強(qiáng)，疏水性降低，α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲的含量降低，β-折疊和β-轉(zhuǎn)角含量升高。分子模擬結(jié)果顯示，山奈酚插入到黃嘌呤氧化酶的疏水空腔，與周?chē)囊恍┲饕被釟埢鏕lu802、Leu873、Phe914、Arg880、

12、Phe1009、Thr1010、Val1011、Leu1014和Pro1076等發(fā)生作用，并與Asn768和Luz1(與Mo原子相連的輔酶因子)形成了兩個(gè)氫鍵。山奈酚對(duì)黃嘌呤氧化酶的抑制作用機(jī)制很可能是因?yàn)樯侥畏硬迦氲近S嘌呤氧化酶的活性位點(diǎn)，不但占據(jù)了黃嘌呤氧化酶的催化中心，阻礙了底物黃嘌呤的進(jìn)入，還誘導(dǎo)黃嘌呤氧化酶的構(gòu)象發(fā)生變化，直接導(dǎo)致黃嘌呤氧化酶的催化活性的降低。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，在山奈酚濃度為0.5×10-6mol/L，山奈酚濃