復(fù)方土茯苓顆粒對(duì)高尿酸血癥黃嘌呤氧化酶的抑制作用.pdf

1、高尿酸血癥是由于體內(nèi)嘌呤代謝異?；蚰蛩崤判拐系K而引起的體內(nèi)血尿酸濃度過(guò)高的一種狀態(tài)，一般以尿酸合成增多或是排泄減少?gòu)亩痼w內(nèi)尿酸積聚為特征。如果體內(nèi)血尿酸長(zhǎng)期處于超飽和的狀態(tài)，則尿酸鹽晶體容易從血液中析出，在關(guān)節(jié)、軟組織和腎臟等部位堆積，形成痛風(fēng)。高尿酸血癥的發(fā)病與經(jīng)濟(jì)發(fā)展程度密切相關(guān)，而且近年來(lái)呈年輕化趨勢(shì)，其嚴(yán)峻程度不容忽視。尿酸合成途徑對(duì)人體內(nèi)尿酸水平的影響極其重要，而黃嘌呤氧化酶是嘌呤代謝合成尿酸的一大關(guān)鍵限速酶，目前市場(chǎng)上許

2、多用于高尿酸血癥的抑制尿酸生成藥物均以黃嘌呤氧化酶為靶點(diǎn)。復(fù)方土茯苓顆粒來(lái)源于經(jīng)驗(yàn)方泄?jié)岢苑剑菍ｉT用于治療高尿酸血癥和痛風(fēng)的中藥方劑。此前課題組已對(duì)該制劑進(jìn)行了多方位的機(jī)制探討，而本課題就復(fù)方土茯苓顆粒對(duì)黃嘌呤氧化酶的抑制作用進(jìn)行研究。
　　目的:
　　本課題通過(guò)文獻(xiàn)綜述研究與實(shí)驗(yàn)研究?jī)纱笳鹿?jié)就復(fù)方土茯苓顆粒對(duì)高尿酸血癥黃嘌呤氧化酶的抑制作用進(jìn)行探討，其中實(shí)驗(yàn)部分包括動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，希望借此繼續(xù)闡明復(fù)方土茯苓顆粒

3、治療高尿酸血癥的多靶點(diǎn)機(jī)制，為該顆粒劑在臨床推廣使用提供證據(jù)支持，對(duì)中醫(yī)治療高尿酸血癥和對(duì)高尿酸血癥的中藥新藥開(kāi)發(fā)提供基礎(chǔ)。
　　方法:
　　文獻(xiàn)綜述研究:本章分為兩個(gè)小節(jié)進(jìn)行綜述，第一小節(jié)就國(guó)內(nèi)外對(duì)高尿酸血癥的發(fā)病機(jī)制、高尿酸血癥與其他疾病的關(guān)系、高尿酸血癥的現(xiàn)代西醫(yī)學(xué)治療進(jìn)展、高尿酸血癥的動(dòng)物模型研究等內(nèi)容進(jìn)行文獻(xiàn)回顧，而第二小節(jié)就高尿酸血癥的古代醫(yī)籍記載、高尿酸血癥的中醫(yī)治療方法、中醫(yī)治療高尿酸血癥的作用機(jī)制研究以及復(fù)

4、方土茯苓顆粒的前期研究工作進(jìn)行回顧，最后進(jìn)行發(fā)展現(xiàn)狀與前景分析。
　　實(shí)驗(yàn)研究:
　　(1)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分:選用48只200g±20 g的SPF級(jí)雄性SD大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)后隨機(jī)分成6組，即A空白組、B模型組、C西藥對(duì)照組、D中藥低劑量組、E中藥中劑量組和F中藥高劑量組。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后，除空白組外，其余各組給予氧嗪酸鉀100mg/kg腹腔注射和次黃嘌呤500mg/kg灌胃以誘導(dǎo)高尿酸血癥。造模劑給藥每天1次，持續(xù)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，造模共8

5、天。在實(shí)驗(yàn)的第4天開(kāi)始，給予造模劑0.5小時(shí)后，中藥低劑量組、中劑量組和高劑量組分別按1g/kg，2g/kg，4g/kg的劑量給予復(fù)方土茯苓顆粒溶液灌胃，而西藥對(duì)照組則以非布司他4mg/kg劑量灌胃，模型組與空白組僅以適量生理鹽水灌胃。治療藥物每天1次，共治療5天。整個(gè)實(shí)驗(yàn)持續(xù)8天。最后一次給藥后通過(guò)心臟采血收集血液，剖腹收集肝臟兩小塊，一塊快速置入液氮保存，另一塊以4％多聚甲醛固定后。血液樣本經(jīng)過(guò)離心抽離血清進(jìn)行尿酸檢測(cè)，液氨保存的肝

6、臟制成10％的組織勻漿后檢測(cè)黃嘌呤氧化酶(XO)活性，甲醛固定的肝臟組織進(jìn)行原位雜交檢測(cè)黃嘌呤氧化酶基因表達(dá)。
　　(2)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)部分:采用SPF級(jí)250g-280g的雄性大鼠每天灌藥2次、連續(xù)5天的方法制備復(fù)方土茯苓顆粒中藥血清;從模板細(xì)胞中抽取并擴(kuò)增XDH基因構(gòu)建到質(zhì)粒pENTER中成為重組質(zhì)粒pENTER-XDH，并經(jīng)雙酶切鑒定和測(cè)序鑒定后進(jìn)行擴(kuò)增和去內(nèi)毒素抽提;體外培養(yǎng)大鼠BRL3A肝細(xì)胞，穩(wěn)定傳代后，對(duì)所制得的中藥血清進(jìn)

7、行細(xì)胞活性檢驗(yàn)，然后把細(xì)胞分成6組，即空白對(duì)照組、轉(zhuǎn)染對(duì)照組、空白大鼠血清組、中藥血清低劑量組、中藥血清中劑量組和中藥血清高劑量組，把重組質(zhì)粒pENTER-XDH轉(zhuǎn)染到空白組以外的BRL細(xì)胞24小時(shí)后，空白大鼠血清組加入黃嘌呤溶液和空白大鼠血清，中藥血清低、中、高劑量組分別加入低、中、高濃度的中藥血清和黃嘌呤溶液。處理24小時(shí)后收集細(xì)胞培養(yǎng)液檢測(cè)尿酸水平與黃嘌呤氧化酶活性，最后裂解細(xì)胞、抽提總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行熒光定量PC

8、R檢測(cè)XDH-mRNA表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　文獻(xiàn)綜述研究:
　　(1)高尿酸血癥的現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究:高尿酸血癥的主要特征是人體內(nèi)尿酸濃度的上升，而高尿酸血癥的發(fā)病機(jī)制主要包括①家庭遺傳性;②體內(nèi)高嘌呤狀態(tài);③嘌呤合成尿酸代謝異常;④尿酸排泄障礙。高尿酸血癥的發(fā)病還與多種疾病有關(guān)系，其中包括高血壓、糖尿病、冠心病與腎功能損害。西醫(yī)治療高尿酸血癥的藥物主要包括有抑制尿酸生成藥物、促進(jìn)尿酸排泄藥物、尿酸酶替代劑，但使用上均

9、有一定的副作用。高尿酸血癥模型目前使用較多的為嚙齒類動(dòng)物及禽類動(dòng)物模型，均存在一定缺陷。
　　(2)高尿酸血癥的中醫(yī)學(xué)研究:高尿酸血癥在古籍中沒(méi)有相應(yīng)病名，按其后期病機(jī)可歸于痹證、歷節(jié)等疾病，古籍中有相當(dāng)多的相方辨證與經(jīng)方記載。而現(xiàn)代中醫(yī)工作者主要以辨病與辨證結(jié)合的方式治療高尿酸血癥，并對(duì)中藥及中藥復(fù)方治療高尿酸血癥的作用機(jī)制作出了大量研究。
　　實(shí)驗(yàn)研究:
　　(1)動(dòng)物實(shí)驗(yàn):模型組血尿酸水平要遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)空白組，差異具

10、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，表明造模方法有效;西藥對(duì)照組與模型組相比，其血尿酸水平顯著降低(P＜0.05)，表明西藥治療有效;而中藥低、中、高濃度三組中，低濃度組的血尿酸水平與模型組相比，差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，中濃度組、高濃度組的血尿酸水平均明顯低于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明中、高濃度組則能有效使模型大鼠血尿酸降低，其中，高劑量組血尿酸下降更明顯，與西藥對(duì)照組無(wú)明顯差別。XO活性檢測(cè)中，相比于空白組

11、，模型組大鼠經(jīng)造模誘導(dǎo)后，XO活性顯著提高（P＜0.05）。西藥對(duì)照組經(jīng)非布司他治療，XO活性相比于模型組也明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），達(dá)到治療效果;三個(gè)中藥組中，中劑量組和高劑量組的XO活性相比于模型組明顯下降（P＜0.05），其中，高劑量組的XO活性與西藥對(duì)照組的程度相當(dāng)，沒(méi)有明顯差別(P＞0.05)。原位雜交檢測(cè)中，模型組的XDH-mRNA表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于空白組，說(shuō)明模型組大鼠在接受造模劑誘導(dǎo)后，肝臟內(nèi)XDH-mR

12、NA表達(dá)量大大增加（P＜0.05）。西藥組大鼠在西藥非布司他干預(yù)下，XDH-mRNA表達(dá)量比模型組顯著下降(P＜0.05)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。中藥各劑量組中，中、高劑量組則明顯下降（P＜0.05），其中，高劑量組與西藥組沒(méi)有明顯差別(P＞0.05)。
　　(2)細(xì)胞實(shí)驗(yàn):重組質(zhì)粒pENTER-XDH進(jìn)行PCR產(chǎn)物核酸電泳鑒定及雙酶切鑒定，酶切后的插入片段與PCR產(chǎn)物在同一水平，這與XDH的基因長(zhǎng)度相符，即重組質(zhì)粒構(gòu)建成功;CCK

13、-8檢測(cè)中，含10％胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基與大鼠空白血清和復(fù)方土茯苓顆粒中藥血清經(jīng)過(guò)對(duì)過(guò)后，差異并沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，且數(shù)值極低，因此可以認(rèn)為對(duì)OD值也沒(méi)有太大影響，而大鼠空白血清和中藥血清處理的細(xì)胞與正常細(xì)胞OD值也沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，即大鼠空白血清和中藥血清對(duì)細(xì)胞活性沒(méi)有明顯的影響;XDH-mRNA的qPCR檢測(cè)中，相比于空白對(duì)照組，轉(zhuǎn)染對(duì)照組的目的基因XDH-mRNA表達(dá)水平大大提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0

14、.05），證明轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pENTER-XDH成功，基因順利進(jìn)行遺傳表達(dá)，空白大鼠血清組相對(duì)于轉(zhuǎn)染對(duì)照組，XDH-mRNA基因表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化(P＞0.05)，說(shuō)明正常的大鼠血清對(duì)XDH基因的表達(dá)沒(méi)有明顯的影響;高劑量組與空白大鼠血清組或轉(zhuǎn)染對(duì)照組比較有明顯差異，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，說(shuō)明中藥血清高劑量組可以明顯抑制XDH基因表達(dá)水平;而中藥血清中劑量組在數(shù)據(jù)上看有明顯降低表達(dá)的趨勢(shì)，但統(tǒng)計(jì)學(xué)比較沒(méi)有顯現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P

15、＞0.05)，考慮與樣本量有關(guān)。尿酸與XO活性檢測(cè)中，空白大鼠血清組的尿酸水平明顯高于空白對(duì)照組和轉(zhuǎn)染對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而XO活性來(lái)說(shuō)，轉(zhuǎn)染對(duì)照組與空白大鼠血清組都明顯高于空白對(duì)照組;轉(zhuǎn)染對(duì)照組的尿酸水平與空白對(duì)照組相比沒(méi)有顯著差異，提示細(xì)胞因?yàn)槟蛩崆绑w物質(zhì)不多，尿酸合成受到限制。各個(gè)課題的中藥血清組與空白大鼠血清組相比，中藥血清中劑量組與高劑量組的尿酸水平和XO活性要相對(duì)更低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），

16、說(shuō)明中藥血清高、中劑量可以明顯抑制尿酸生成和抑制XO活性。而在中、高劑量?jī)山M的對(duì)比中，高劑量組抑制作用更明顯（P＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　復(fù)方土茯苓顆粒治療高尿酸血癥、使血尿酸下降的其中一個(gè)機(jī)制，很可能就是通過(guò)直接或間接的作用抑制肝臟中XDH-mRNA的表達(dá)水平，降低XO的活性單位，減少尿酸生成;體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)復(fù)方土茯苓顆粒中藥血清可能通過(guò)抑制大鼠肝細(xì)胞中過(guò)表達(dá)的XDH-mRNA基因水平和黃嘌呤氧化酶的活性，從而降低尿