胃癌組織中miR-191的初步研究.pdf

1、研究背景：
　　自1993年在線蟲中發(fā)現(xiàn)了第一個microRNA（miRNA）—Lin-4以來，miRNA逐漸受到科學(xué)家們的關(guān)注。它們是一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼 RNA（ncRNA），通過堿基互補配對的方式識別靶mRNA，并根據(jù)互補程度的不同在轉(zhuǎn)錄后水平對靶基因的翻譯進(jìn)行抑制或降解靶mRNA。大量的研究表明miRNA參與各種各樣的調(diào)節(jié)途徑，包括發(fā)育、病毒防御、造血過程、器官形成、細(xì)胞增殖和凋亡、脂肪代謝等等。隨著對miRN

2、A的研究的深入，眾多的研究發(fā)現(xiàn)miRNA在腫瘤的形成中發(fā)揮著類似癌基因或抑癌基因的作用。目前許多國內(nèi)外的學(xué)者對miRNA在多種腫瘤中的表達(dá)及其與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、治療及預(yù)后的關(guān)系進(jìn)行了相關(guān)的研究工作。但關(guān)于miRNA在胃癌中表達(dá)情況的研究尚需加強。
　　有研究者利用基因芯片技術(shù)檢測出miR-191在多種腫瘤中呈異常表達(dá)，其中在胃癌呈高表達(dá)，但利用實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，qRT-PCR

3、）等檢測方法對其結(jié)果的驗證尚缺乏，與胃癌的臨床病理特征的關(guān)系所知尚少，而且，miR-191在胃癌中是通過哪個靶基因發(fā)揮作用更是尚未有相關(guān)報道。
　　目的：
　　1．用實時熒光定量PCR檢測miR-191在胃癌中的表達(dá)情況，并分析與胃癌的臨床病理特征的關(guān)系。
　　2.利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測miR-191的靶基因。
　　3.用免疫組化方法對靶基因在胃癌組織中表達(dá)情況進(jìn)行檢測，分析miR-191與靶基因表達(dá)情況的關(guān)系，

4、為miR-191的后續(xù)功能研究提供重要依據(jù)。
　　方法：
　　1.選取胃癌及配對癌旁正常組織(距癌腫5cm以上)標(biāo)本50例提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，應(yīng)用基于LNA技術(shù)的qRT-PCR（SYBR GreenⅠ染料法）及2-ΔΔCT相對定量法檢測miR-191在胃癌及配對癌旁正常組織的表達(dá)情況。
　　2.按照不同的臨床病理特征（性別、年齡、病理組織學(xué)分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期）對胃癌病人進(jìn)行分組，通過組間對比分析

5、miR-191與各臨床、病理指標(biāo)的關(guān)系。
　　3.利用相關(guān)生物信息學(xué)軟件（MiRanda、TargetScan及 PicTar）對miR-191進(jìn)行靶基因預(yù)測，取3個軟件均預(yù)測到的基因作為靶基因。
　　4.用免疫組化對靶基因在胃癌和配對癌旁正常組織中的表達(dá)情況進(jìn)行檢測，并分析與miR-191表達(dá)情況的相關(guān)性。
　　結(jié)果：
　　1.qRT-PCR結(jié)果顯示：應(yīng)用2-ΔΔCT進(jìn)行相對定量分析，與配對癌旁正常組織相比，6

6、8％（34/50例）胃癌組織的miR-191呈高表達(dá)，miR-191在胃癌組織中的表達(dá)量0.0314（0.0037~0.4924）是配對正常組織0.0240（0.0037~0.1593）的2.01倍，有顯著性差異（P<0.05）。
　　2.按性別、年齡、病理組織學(xué)分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期對胃癌病人分別進(jìn)行分組，各組間miR-191表達(dá)情況均無顯著差異性（P>0.05）。
　　3.有9個基因在三個軟件中均被預(yù)測為miR-1

7、91的靶基因，它們是：PLCD1、SOX4、RNF139、FZD5、GAP43、TJP1、TMOD2、NDST1和AMMECR1。
　　4.對胃癌及配對癌旁正常組織的PLCD1進(jìn)行免疫組化檢測，發(fā)現(xiàn)PLCD1均在上皮細(xì)胞胞漿染色表達(dá)。96.7%（29/30例）癌旁正常組織中的PLCD1表達(dá)呈（+）或（++），而胃癌組織中僅56.7%（17/30例）表達(dá)（+）或（++），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。與配對正常組織相比，70%（

8、21/30）胃癌組織中的PLCD1表達(dá)陰性或強度下降。有90%（18/20例）miR-191表達(dá)增高的胃癌組織中PLCD1表達(dá)強度下降，而只有30%（3/10）miR-191表達(dá)降低的胃癌組織中 PLCD1表達(dá)強度下降。對miR-191與PLCD1在胃癌組織中表達(dá)水平進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示兩者呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.639，P<0.01）。
　　結(jié)論：
　　1.本實驗應(yīng)用基于LNA技術(shù)的qRT-PCR（染料法SYBR Gr

9、eenⅠ）驗證了miR-191在胃癌組織中呈高表達(dá)。
　　2. miR-191在胃癌組織中的表達(dá)量與相關(guān)的臨床病理特征（性別、年齡、病理組織學(xué)分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期）無相關(guān)性。
　　3.利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測了9個基因（PLCD1、SOX4、RNF139、FZD5、GAP43、TJP1、TMOD2、NDST1和AMMECR1）為miR-191的靶基因。
　　4.運用免疫組化方法觀察到PLCD1在胃癌組織中呈低表達(dá)