第二代高通量測序分析VVC及RVVC患者陰道菌群結(jié)構(gòu).pdf

1、女性生殖道是人體四大生態(tài)系統(tǒng)中較復(fù)雜的一個生態(tài)系統(tǒng)，由陰道解剖結(jié)構(gòu)、內(nèi)分泌調(diào)節(jié)以及微生態(tài)菌群共同組成。由于受到環(huán)境變化、藥物刺激、宿主的激素水平和免疫狀態(tài)等因素的影響，女性生殖道內(nèi)的微生態(tài)菌群平衡狀態(tài)被打破而失衡，從而導(dǎo)致疾病的發(fā)生。全面了解陰道微生態(tài)的菌群組成以及動態(tài)變化，有助于我們了解生殖道感染疾病的發(fā)生、發(fā)展過程，進(jìn)一步指導(dǎo)臨床采取及時的干預(yù)措施，使用適當(dāng)?shù)乃幬镏委?，避免濫用藥物治療。
　　由于陰道菌群主要為厭氧茵，培養(yǎng)營養(yǎng)

2、條件要求苛刻，使用傳統(tǒng)培養(yǎng)和分離鑒定的方法很難全面認(rèn)識陰道菌群構(gòu)成，限制了對陰道微生物群落菌群多樣性與疾病關(guān)系的進(jìn)一步研究。微生物的分類鑒定從表型特征鑒定深化為基因特征鑒定。16S rRNA基因聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增是目前最常用的檢測陰道微生物的非培養(yǎng)法。我們通過Illumina Solexa高通量測序平臺測序、結(jié)合帶標(biāo)簽的基于熒光測序平臺的雙末端測序(BIPES)，可快速、全面了解陰道微生物群落結(jié)構(gòu)信息，
　　外陰陰道假絲酵

3、母菌病(VVC)是由假絲酵母菌引起的一種常見的外陰陰道炎性疾病，約有5％發(fā)展為復(fù)發(fā)性外陰陰道假絲酵母菌病(RVVC)。因其引起瘙癢等癥狀影響婦女的工作和生活，又因其容易反復(fù)發(fā)作經(jīng)久不愈成為臨床研究的一個難點。VVC、RVVC的發(fā)病與多種因素有關(guān)，發(fā)病機制仍未明確，目前研究提示與陰道內(nèi)自身微生物菌群的結(jié)構(gòu)及微環(huán)境變化有關(guān)。但假絲酵母菌感染后陰道菌群是否發(fā)生改變，如何改變，目前仍無定論。本研究通過Illumina高通量測序技術(shù)以及BIPES

4、的序列研究方法，比較了解健康育齡女性、VVC和RVVC患者的微生物群落結(jié)構(gòu)，追蹤健康育齡女性以及VVC患者陰道菌群隨月經(jīng)周期的動態(tài)變化，為進(jìn)一步探討VVC和RVVC的病因、治療以及預(yù)防提供理論依據(jù)。
　　目的：
　　1、通過Illumina高通量測序技術(shù)以及BIPES的序列研究方法，了解健康育齡女性、VVC和RVVC患者陰道微生物菌群的結(jié)構(gòu)，分析陰道菌群的多樣性改變，了解VVC和RVVC患者在發(fā)作時期陰道菌群與健康育齡女性的

5、差異。
　　2、追蹤健康育齡女性、VVC患者在月經(jīng)周期變化中的陰道菌群結(jié)構(gòu)信息，探討其菌群結(jié)構(gòu)動態(tài)變化的模式及與月經(jīng)周期的關(guān)系。
　　方法：
　　1.實驗對象:
　　實驗一:
　　選取2013年4月～2013年10月就診于佛山市順德區(qū)第一人民醫(yī)院婦科門診的患者12例，平均年齡（28.83±6.10）歲。VVC組5例，納入標(biāo)準(zhǔn):①癥狀:外陰瘙癢、灼痛，伴有尿痛以及性交痛等癥狀:陰道分泌物增多。②體征:外陰潮紅

6、、水腫，可見抓痕，甚至皸裂，小陰唇內(nèi)側(cè)及陰道粘膜附著白色膜狀物，陰道內(nèi)較多的白色分泌物，呈凝乳狀或豆腐渣樣。③實驗室檢查:陰道分泌物鏡檢找到假絲酵母菌的芽孢或菌絲，或培養(yǎng)有白假絲酵母菌、近平滑假絲酵母菌、熱帶假絲酵母菌等生長。RVVC組5例，納入標(biāo)準(zhǔn):①1年中發(fā)作VVC≥4次。②實驗室檢查:陰道分泌物鏡檢找到假絲酵母菌的芽孢或菌絲，或培養(yǎng)有白假絲酵母菌、近平滑假絲酵母菌、熱帶假絲酵母菌等生長。健康組(Healthy)2例，納入標(biāo)準(zhǔn):①無

7、臨床癥狀。②陰道清潔度為Ⅰ～Ⅱ級。③實驗室檢查:陰道分泌物鏡檢未找到假絲酵母菌的芽孢或菌絲。
　　實驗二:
　　2013年6月～2013年9月就診于佛山市順德區(qū)第一人民醫(yī)院婦科門診體檢的健康女性2名，平均年齡(27.00±3.00)歲，納入健康組(Healthy)。納入標(biāo)準(zhǔn):①～③同實驗一;④月經(jīng)正常。VVC組3例，平均年齡(29.00±4.16)歲。納入標(biāo)準(zhǔn):①～③同實驗一;④月經(jīng)正常。
　　以上各組均為我國漢族人，

8、排除標(biāo)準(zhǔn):研究對象1個月內(nèi)無全身應(yīng)用抗生素及陰道局部用藥史，3天內(nèi)無性生活史以及陰道灌洗;排除妊娠期、哺乳期;排除全身系統(tǒng)性疾病如:糖尿病、激素治療性疾?。ㄈ缂甭阅I炎）等;排除滴蟲性、細(xì)菌性陰道病或需氧型陰道炎等。另外實驗二還需滿足以下條件:目前均只有一個性伴侶，采用避孕套避孕或自然避孕法，無口服避孕藥物。
　　2.取樣:實驗一、實驗二各組研究對象知情同意后，用無菌陰道棉拭子于陰道壁中上段取陰道分泌物，標(biāo)本送檢。實驗二研究對象的

9、取樣時間是月經(jīng)周期中的第2、4、7、14、16、21、27天。
　　3.所有標(biāo)本采用DNA提取試劑盒（深圳易瑞）提取樣本總DNA，具體操作步驟參照說明書。
　　4.16s rRNAV4區(qū)基因片段的擴增及Illumina測序:以樣本總DNA為模版，采用引物514F和805R，擴增其中的16S rRNA V4區(qū)基因。PCR產(chǎn)物以相等的終濃度混合均勻，通過Illumina HiSeq2000平臺進(jìn)行雙末端100bp測序（華大基因，

10、深圳）。
　　5.測得序列經(jīng)過BIPES流程進(jìn)行初步處理。使用TSC進(jìn)行聚類，提取出每個操作分類單元(Operational taxonomy unit，OTU)的代表序列后，利用GAST進(jìn)行物種的分類，其中屬于乳酸菌屬的OTU利用megablast進(jìn)一步分到種級別，后續(xù)分析包括聚類分析，Alpha多樣性和Beta多樣性分析?；赨nifrac距離，采用QIIME進(jìn)行陰道菌群主分分析。采用linear discriminant a

11、nalysis(LDA)coupled with effect size measurements(LEfSe)在線工具分析患者特殊的陰道菌群。
　　6.統(tǒng)計學(xué)處理:應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料采用率或構(gòu)成比表示。計量資料組內(nèi)或組間比較采用方差分析，對多樣性指數(shù)、各菌屬的相對豐度進(jìn)行Wilcoxon秩和檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　實驗一:
　　1.測序數(shù)據(jù)采用BIP

12、ES流程進(jìn)行分析，采用UCHIME去除嵌合體序列，本實驗測序樣品數(shù)12個，最終共獲得852992條序列，平均每個樣品71083條。
　　2.根據(jù)QnME分析流程進(jìn)行beta多樣性分析，展示三組菌群之間的相似度。VVC組菌群Beta多樣性最高，分布廣泛。RVVC組分布緊湊，菌群結(jié)構(gòu)相似度高。健康組Beta多樣性介乎RVVC與VVC之間。
　　3.通過PD whole tree比較三組樣品的Alpha多樣性，分析顯示VVC患者的

13、陰道菌群Alpha多樣性最高，提示其菌群Alpha多樣性較RVVC及健康組明顯增加(T-test，P＜0.05)。
　　4.在菌屬的水平上，健康組主要以卷曲乳桿菌為優(yōu)勢菌，達(dá)95％以上。VVC組菌群構(gòu)成呈現(xiàn)多樣化改變，乳桿菌屬豐富度顯著降低，由最多的68％下降至0.2％，加德納菌、普氏菌屬、雙歧桿菌豐富度明顯增加。RVVC組菌群構(gòu)成以惰性乳桿菌為優(yōu)勢菌，約占85％。
　　5.通過LEfSe統(tǒng)計三組菌屬差異發(fā)現(xiàn)，VVC組的放線

14、菌門、雙歧桿菌屬、雙歧桿菌門以及金黃桿菌的豐度較RVVC和健康組明顯增高。而嗜血菌屬在健康組則明顯增高。
　　實驗二:
　　1.測序數(shù)據(jù)采用BIPES流程進(jìn)行分析，采用UCHIME去除嵌合體序列，本實驗測序樣品數(shù)12個，最終共獲得105796條干凈序列，平均每個樣品92610條。
　　2.分別用Chao1、Observed species、PD whole tree、Shannon四個指標(biāo)展示5個研究對象在月經(jīng)周期中陰

15、道菌群的alpha多樣性變化。其中健康組的H2和VVC組的V2的alpha多樣性指數(shù)最低，說明陰道菌屬構(gòu)成相對單一。
　　3.通過計算歐式距離來展示5個研究對象在月經(jīng)周期中陰道菌群的波動。在月經(jīng)第2天的菌群結(jié)構(gòu)與月經(jīng)第7天明顯拉開距離，提示月經(jīng)第7天陰道菌群明顯有變化，陰道優(yōu)勢菌群迅速生長，菌群的多樣性由復(fù)雜化趨向于單一化。
　　4.在菌屬水平上，隨著月經(jīng)周期變化，健康組主要以卷曲乳桿菌為優(yōu)勢菌，VVC組陰道菌群結(jié)構(gòu)相對復(fù)雜

16、，陰道優(yōu)勢菌群可為惰性乳桿菌(2/3)，也可為加德納菌(1/3)。整個月經(jīng)周期陰道菌群處于相互交替的動態(tài)變化中。陰道菌群多樣性增高，則月經(jīng)周期中菌群波動較明顯。
　　5.選取OUT數(shù)量最多的前15位菌屬，通過折線圖可見5個研究對象陰道菌群在月經(jīng)周期中的均有變化。陰道優(yōu)勢菌群的變化顯示有2種模式:一種模式是相互交替變化:自月經(jīng)期后陰道優(yōu)勢菌迅速生長至排卵期前達(dá)高峰，在排卵期（月經(jīng)第14天）開始出現(xiàn)下降，至月經(jīng)期達(dá)最低點，其他陰道菌群

17、則相應(yīng)增多;另外一種模式是保持絕對優(yōu)勢的模式。自月經(jīng)期后，陰道優(yōu)勢菌大量生長，一直保持較高的豐富度，至月經(jīng)前期才出現(xiàn)逐漸下降。
　　結(jié)論：
　　1.健康育齡女性和RVVC患者陰道菌群結(jié)構(gòu)簡單，VVC患者菌群多樣性增高。
　　2.健康女性陰道優(yōu)勢菌群為卷曲乳桿菌，RVVC患者則以惰性乳桿菌為優(yōu)勢菌群。VVC患者陰道菌群的乳桿菌屬比例降低，加德納菌、普氏菌屬、雙歧桿菌等菌屬豐富度增加。
　　3.陰道菌群隨月經(jīng)周期的變