利用靶標序列捕獲結合第二代測序技術進行胃癌樣本中激酶基因結構變異的發(fā)現(xiàn)研究.pdf

1、激酶在各種生命活動中起著重要的作用。一些激酶的突變是導致腫瘤發(fā)生的重要原因之一，引起細胞增殖、凋亡等行為的異常。對于引起腫瘤發(fā)生有至關重要作用的激酶，可作為治療腫瘤的靶點，并且為人類腫瘤病人的早期診斷和個體化靶向治療提供可能。與G 蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）相似，激酶是目前藥物研發(fā)的一大類重要的靶點。識別激酶中的影響蛋白質(zhì)序列的基因突變，對于理解激酶對疾病發(fā)生發(fā)展的機制具有重要的價值，人類基因組計劃完成后的基因芯片技術和新一代基因組測序技

2、術的發(fā)展，使得發(fā)現(xiàn)更多的基因突變更加便利。
　　 本文利用SureSelect液相捕獲目標基因結合第二代測序技術發(fā)現(xiàn)激酶基因在胃癌組織中的新突變及短片段的Inde l。利用Agilent公司的eArray在線平臺，對1 250個基因的外顯子區(qū)域進行捕捉探針(釣餌)設計，包括518 個激酶基因，638 個GPCR基因，49 個ABC基因，45 個選自Cosmic數(shù)據(jù)庫中的基因。以3 例胃癌患者的手術胃癌組織、癌旁非癌組織以及其中2

3、 人的外周血樣本，提取基因組DNA，進行SureSelect 液相捕獲，并在SOLiD3 第二代測序儀上進行測序。結果顯示設計合成的探針可有效地捕捉并富集基因組DNA的目標靶片段，定量PCR顯示富集效率可達29倍。擁有高達81.33％的富集效率及相對較高的平均覆蓋度。有95％的目標區(qū)域>1×覆蓋度，平均測序深度為260×。經(jīng)過數(shù)據(jù)分析，共發(fā)現(xiàn)315 個激酶基因的818 個單核苷酸變異（SNV）。其中59 個（7.2％）為公共數(shù)據(jù)庫尚未有

4、收錄的全新SNV。我們得到104 個激酶基因的312 個SNV是改變氨基酸影響蛋白質(zhì)的，其中225 個SNV是在所有的腫瘤組織中都有發(fā)現(xiàn)。最終有35 個新的非同義SNV被發(fā)現(xiàn)。同時我們選擇了5 個SNV（PRKACA（P127S）、 PRKACG（rs3730386）、RPS6KB2（T228N）、LTK（R727H）以及MAP3K6 （rs1138294））進行Sanger測序驗證，并且再檢測這些突變在32 個胃癌細胞系和89 例胃癌

5、石蠟樣本中的存在情況。結果顯示在5（15.7％）例細胞系和16 （18.0％）例臨床胃癌石蠟樣本中檢測到新突變PRKACA（P127S），在15（46.9％）例細胞系和50（56.2％）例石蠟樣本中檢測到已知突變PRKACG（rs3730386）， 63（70.8％）例臨床胃癌石蠟樣本中存在已知突變MAP3K6（rs1138294）。同時，我們還發(fā)現(xiàn)71 個激酶基因發(fā)生26 個小的缺失和74 個小的插入。通過Sanger測序法驗證了MA