糖原分解在星形膠質(zhì)細(xì)胞調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)K+穩(wěn)態(tài)和ATP釋放中的作用及其分子機(jī)制.pdf

1、在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，腦內(nèi)神經(jīng)元或者膠質(zhì)細(xì)胞異常活動(dòng)時(shí)對(duì)能量需求量增加，而腦內(nèi)能量?jī)?chǔ)存有限導(dǎo)致能量需求和供給出現(xiàn)失衡，從而導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)離子失衡、凋亡和不可逆死亡等一系列病理性變化和功能紊亂。星形膠質(zhì)細(xì)胞通過調(diào)控中樞神經(jīng)系統(tǒng)的能量需求和供給平衡，潛在保護(hù)神經(jīng)元，其對(duì)于神經(jīng)元的功能發(fā)揮與轉(zhuǎn)歸生存起到?jīng)Q定性作用。
　　星形膠質(zhì)細(xì)胞能量供給的主要來源是葡萄糖代謝和糖原分解。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，重要的能量底物之一葡萄糖主要依賴于腦部血供，而且

2、在神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞中也有分布，而另一重要能量底物糖原只局限性地分布在星形膠質(zhì)細(xì)胞中。糖原分解和葡萄糖分解的過程中產(chǎn)生相同的中間產(chǎn)物葡萄糖-6-磷酸，然而兩者的葡萄糖-6-磷酸去向卻不完全相同，葡萄糖在消耗1分子ATP磷酸化和關(guān)鍵酶己糖激酶催化下生成的葡萄糖-6-磷酸主要轉(zhuǎn)化為丙酮酸，進(jìn)入三羧酸循環(huán)的有氧代謝和無氧酵解;糖原在糖原磷酸化酶作用下生成的葡萄糖-6-磷酸主要轉(zhuǎn)化為葡萄糖，補(bǔ)充葡萄糖的含量不足。傳統(tǒng)研究理論認(rèn)為糖原只是腦內(nèi)能

3、量的儲(chǔ)存形式，只有在葡萄糖等主要能量底物出現(xiàn)耗竭時(shí)才啟動(dòng)糖原分解，糖原非還原端經(jīng)連續(xù)水解提供維持葡萄糖含量恒定或者補(bǔ)充葡萄糖含量的不足。但是糖原生成的葡萄糖-6-磷酸也可直接進(jìn)入三羧酸循環(huán)的有氧代謝和無氧酵解，提供能量支持。然而糖原不轉(zhuǎn)化成葡萄糖，而直接進(jìn)入有氧代謝和無氧酵解的主要激活因素尚不清楚。
　　Swanson曾于1992年率先報(bào)道星形膠質(zhì)細(xì)胞的糖原分解直接參與應(yīng)激提供能量支持。應(yīng)激過程中所需能量急劇增加，糖原以葡萄糖-6

4、-磷酸進(jìn)入有氧代謝供能，可能與糖原分解具有瞬間啟動(dòng)和連續(xù)分解優(yōu)勢(shì)相關(guān)，因此優(yōu)于葡萄糖而在應(yīng)激發(fā)生時(shí)被選擇利用，然而激活糖原分解的機(jī)制尚不明確。另有研究報(bào)道星形膠質(zhì)細(xì)胞的糖原分解在長(zhǎng)期記憶形成和谷氨酸合成中起到重要作用。糖原分解以葡萄糖-6-磷酸形式直接進(jìn)入有氧代謝和無氧酵解，與葡萄糖相比具有明顯優(yōu)勢(shì)，瞬間啟動(dòng)，連續(xù)分解，高敏感性和高ATP生成量等。糖原的重要角色可能如同星形膠質(zhì)細(xì)胞在早期研究被忽略一般，因此，大膽地提出推測(cè):糖原分解可能

5、對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)起著至關(guān)重要的作用。
　　中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元正常發(fā)揮功能的重要前提是維持微環(huán)境的K+穩(wěn)態(tài)。K+作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的陽離子，存在一定的不同程度的濃度波動(dòng)。其中，神經(jīng)元過度興奮產(chǎn)生變化幅度略小的生理性K+升高，約3-8 mM;當(dāng)腦部出現(xiàn)缺血缺氧等嚴(yán)重的病理性疾病時(shí)，常伴隨大幅度的病理性K+顯著性升高，大于8mM，甚至高達(dá)50 mM。星形膠質(zhì)細(xì)胞調(diào)控微環(huán)境K+穩(wěn)態(tài)，快速攝取細(xì)胞外多余的K+，縮短神經(jīng)元超極化時(shí)程

6、，恢復(fù)神經(jīng)元的接受下一個(gè)脈沖的興奮性，潛在保護(hù)神經(jīng)元，有助于恢復(fù)大腦的正常功能。中樞神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞外生理性高K+激活的K+攝取入細(xì)胞內(nèi)，主要依賴于星形膠質(zhì)細(xì)胞的Na+，K+-ATP酶，而非神經(jīng)元的Na+，K+-ATP酶作用。分析此時(shí)為何神經(jīng)元的Na+，K+-ATP酶無K+攝取作用，從激活Na+，K+-ATP酶需要同時(shí)滿足的三個(gè)條件考慮，其可能原因是神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞Na+，K+-ATP酶的離子親和力和受離子調(diào)控條件完全不同，但是最主要

7、在于供能ATP上的差異在于腦內(nèi)的糖原只分布在星形膠質(zhì)細(xì)胞中，而神經(jīng)元內(nèi)無糖原分布。因此，糖原分解可能作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞攝取細(xì)胞外生理性高K+。中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞外病理性高K+激活Na+，K+-ATP酶，其介導(dǎo)2個(gè)K+內(nèi)流和3個(gè)Na+外流造成細(xì)胞外同時(shí)高鉀和高鈉的高滲性的離子梯度，繼而激活了同向轉(zhuǎn)運(yùn)離子入細(xì)胞內(nèi)的鈉鉀氯共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Na+-K+-2Cl-cotransporter1，NKCC1)及其相關(guān)通路。前期研究證實(shí)其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要是病

8、理性高K+致星形膠質(zhì)細(xì)胞去極化，活化L-型鈣通道造成鈣離子內(nèi)流，激活金屬蛋白酶ADAM17釋放HB-EGF，與細(xì)胞膜上的EGFR結(jié)合激活Ras/Raf/MEK/ERK1/2經(jīng)典MAPK通路，ERK1/2直接激活或者通過WNT間接激活NKCC1?；罨腘KCC1同向攝取Na+，K+，Cl-進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，且伴隨著水分子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)致細(xì)胞水腫。病理性高K+所需能量是否與生理性高K+能量代謝情況一致，以及是否存在葡萄糖代謝和糖原分解的選擇性問題還

9、尚不清楚。
　　此外，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)遞質(zhì)具有一定激活糖原分解效應(yīng)，其可能兩個(gè)主要原因:神經(jīng)遞質(zhì)可以直接激活糖原分解的磷酸酶/磷酸激酶通路系統(tǒng);神經(jīng)遞質(zhì)可以激活依賴于糖原分解的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路從而激活糖原分解。神經(jīng)遞質(zhì)激活A(yù)TP釋放是否依賴于其激活的糖原分解供能，目前國(guó)內(nèi)外相關(guān)報(bào)道甚少，有待于進(jìn)一步研究證實(shí)糖原分解在ATP釋放中的作用及其機(jī)制。
　　深入研究糖原分解在星形膠質(zhì)細(xì)胞調(diào)節(jié)K+穩(wěn)態(tài)和ATP釋放中的作用，有助于為腦部能

10、量相關(guān)疾病的診斷、治療和預(yù)防研究提供一條新途徑。星形膠質(zhì)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與糖原分解密切相關(guān)，但其涉及的具體分子作用機(jī)制尚不清楚。因此本課題旨在證實(shí)糖原分解是星形膠質(zhì)細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)的重要能量來源，深入探討糖原分解在星形膠質(zhì)細(xì)胞高K+激活的K+穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)和神經(jīng)遞質(zhì)激活A(yù)TP釋放中的作用機(jī)制及其分子機(jī)制。
　　方法：
　　采用原代培養(yǎng)的小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞。用dBcAMP處理細(xì)胞1周后，①模擬生理性高K+和病理性高K+，使用糖原分解抑制

11、劑DAB處理，和/或IP3受體抑制劑，和/或鈉離子通道抑制劑，或者采用siRNA方法沉默解聚素金屬蛋白酶ADAM17基因后，檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞攝取K+活性變化，ERK1/2磷酸化水平，細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平變化;②神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸、腺苷、GABA、高K+，使用糖原分解抑制劑DAB處理，或IP3受體抑制劑，或L-鈣通道抑制劑，或EGF受體抑制劑，或金屬蛋白酶抑制劑，或GluK2抑制劑，或MEK抑制劑U0126，采用熒光素酶法檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放A

12、TP以及糖原分解變化。使用SPSS12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組資料用one-way ANOVA方法進(jìn)行比較，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1、高K+依賴于糖原分解激活星形膠質(zhì)細(xì)胞攝取K+
　　生理性高K+（即+5mMK+)介導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞攝取K+能力增高。在含有10mM葡萄糖的等滲液中，應(yīng)用糖原分解抑制劑DAB仍能明顯抑制+5mMK+引起的細(xì)胞內(nèi)K+濃度的升高。表明此攝取過程是糖原分解依賴性

13、。IP3受體抑制劑Xestospongin和鈉離子通道抑制劑阿咪洛利具有抑制效應(yīng)，表明激活糖原分解攝取K+與升高細(xì)胞內(nèi)鈣離子和鈉離子密切相關(guān)。
　　2、細(xì)胞外高Na+狀態(tài)下的差異性
　　Na+/H+交換體抑制劑monensin與DAB共同作用是部分抑制+5 mMK+引起的細(xì)胞內(nèi)K+升高。10 mM丙酮酸鈉和氯化鈉具有相似的K+回升效應(yīng)，表明細(xì)胞內(nèi)高Na+足以激活Na+，K+-ATP酶的情況下，其消耗的能量依賴于葡萄糖的代謝提

14、供的ATP，與單純性細(xì)胞外生理性高K+情況存在明顯差異性。
　　3、病理性高K+激活的糖原依賴性和鈣鈉通道特異性
　　病理性高K+提高細(xì)胞內(nèi)K+幅度約為+5 mMK+升高幅度的2-3倍，表明其為Na+, K+-ATP酶和NKCC1協(xié)同作用的結(jié)果。且依賴于糖原分解以及與細(xì)胞內(nèi)Ca2+密切相關(guān)，但細(xì)胞內(nèi)高Na+僅能恢復(fù)激活Na+，K+-ATP酶活性，而對(duì)NKCC1無效。
　　4、哇巴因與生理性高K+具有相似的激活ERK1/

15、2磷酸化信號(hào)通路效應(yīng)
　　哇巴因介導(dǎo)的ERK1/2磷酸化受EGF受體抑制劑AG1478，而金屬蛋白酶抑制劑GM6001無法抑制。+5mMK+和+10 mM K+不同程度地增高ERK1/2磷酸化水平。且+5 mMK+激活效應(yīng)同哇巴因激活效應(yīng)相同，均屬于激活Na+，K-ATP酶的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。且其通路中部分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子同樣參與到+10 mM K+激活NKCC1的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中;然而IP3選擇性僅參與哇巴因類激活的相關(guān)通路。
　　

16、5、Ca2+與糖原分解在介導(dǎo)哇巴因類信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中密切相關(guān)
　　+5mMK+明顯提升細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度，且糖原分解抑制劑DAB能抑制游離Ca2+水平升高的效應(yīng)，表明糖原作為特殊的能量底物為+5 mMK+激活Na+，K+-ATP酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路提供能量支持，且與Ca2+密切相關(guān)。
　　6、神經(jīng)遞質(zhì)和高K+依賴于糖原分解激活A(yù)TP釋放
　　谷氨酸、腺苷、GABA和高K+明顯激活星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放ATP，且糖原分解抑制劑DA

17、B能抑制ATP釋放增加的效應(yīng)，表明糖原分解是神經(jīng)遞質(zhì)和高K+激活A(yù)TP釋放的重要的能量來源。
　　討論：
　　本課題目前實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)高K+和多種神經(jīng)遞質(zhì)可激活星形膠質(zhì)細(xì)胞的糖原分解，且糖原分解在細(xì)胞外生理性高K+介導(dǎo)Na+，K+-ATP酶以及病理性高K+共同介導(dǎo)Na+，K+-ATP酶和NKCC1的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)揮重要作用，深入探討得知與細(xì)胞內(nèi)鈉離子和鈣離子濃度和通道開放密切相關(guān)，+5 mMK+介導(dǎo)哇巴因類攝取鈉內(nèi)流從而激活

18、Na+，K+-ATP酶細(xì)胞內(nèi)鈉離子活化位點(diǎn)，且依賴于細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高。另有研究糖原分解參與谷氨酸合成過程，維持谷氨酸含量。在胰腺癌中發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的過度增殖和侵襲由糖原分解提供能量代謝，其過程也證實(shí)并非全部依賴于血糖提供能量。糖原作為能量底物為腫瘤的發(fā)生和增殖的部分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路提供相應(yīng)的能量支持。
　　模擬生理性高K+和病理性高K+介導(dǎo)Na+，K+-ATP酶和NKCC1通路中都存在激活ERK1/2的磷酸化。本課題中采用的哇巴因，

19、是一種nM級(jí)低濃度激活Na+，K+-ATP酶的內(nèi)源性神經(jīng)遞質(zhì)。研究哇巴因相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要是為了證實(shí)+5mMK+介導(dǎo)激活Na+，K+-ATP酶的相關(guān)特異性受體和離子通道，以及糖原作為能量底物為+5 mMK+介導(dǎo)激活Na+，K+-ATP酶提供能量支持。應(yīng)用IP3受體特異性抑制劑完全抑制+5mMK+激活p-ERK1/2，表明IP3受體選擇性參與激活哇巴因信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，且未參與到+10mMK激活NKCC1通路中。此外，30nM哇巴因和+5

20、mMK+激活p-ERK1/2水平受抑制效果證實(shí)Src和EGF受體共同參與活化Na+，K+-ATP酶通路中。Ca2+可能并非直接作用于糖原，以Ca2+/鈣調(diào)蛋白結(jié)合糖原磷酸酶激酶的亞基，活化糖原磷酸化酶/激酶系統(tǒng)激活糖原分解，此作用方式與β腎上腺素活化的cAMP相似。
　　本課題通過實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證實(shí)在細(xì)胞外內(nèi)環(huán)境出現(xiàn)生理性高K+和病理性高K+時(shí)，星形膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)Na+，K+-ATP酶和NKCC1攝取K+入細(xì)胞內(nèi)，有助于暫時(shí)性恢復(fù)神經(jīng)系統(tǒng)

21、外環(huán)境的K+穩(wěn)態(tài)，但是星形膠質(zhì)細(xì)胞只是暫時(shí)性攝取K+蓄積，細(xì)胞內(nèi)K+濃度上升持續(xù)時(shí)間很短，繼而K+釋放到細(xì)胞外，神經(jīng)元通過鉀離子通道再攝取K+，有助于恢復(fù)神經(jīng)元構(gòu)成正常的靜息電位和興奮性。由于星形膠質(zhì)細(xì)胞依賴于高K+激活的糖原分解攝取K+過程，在非應(yīng)激狀態(tài)無法激活糖原分解，導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞無法參與正常穩(wěn)態(tài)K+的攝取，即非應(yīng)激狀態(tài)維持K+穩(wěn)態(tài)水平和調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性的K+持續(xù)攝取和釋放，可能直接由神經(jīng)元在葡萄糖作為能量底物供能下完成。<

22、br>　　結(jié)論：
　　在原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞中，糖原分解是星形膠質(zhì)細(xì)胞調(diào)節(jié)K+穩(wěn)態(tài)和ATP釋放的重要能量來源。糖原分解為星形膠質(zhì)細(xì)胞快速攝取細(xì)胞外高K+提供能量，且糖原分解由高K+所激活。高K+激活糖原分解的信號(hào)通路是生理性高K+介導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞Src活化EGFR受體后，分別通過Ras/Raf/MEK/ERK1/2和PLC/PIP2/IP3/Ca2+兩條不同信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，而病理性高K+介導(dǎo)Na+，K+-ATP酶基礎(chǔ)上協(xié)同活化L-鈣